日本理化學研究所（以下簡稱「理研」）放射光科學研究中心的香村芳樹組長等人組成的國際聯合研究團隊全球首次成功開發出了X射線區域的高解析度光片顯微鏡（光片顯微鏡）。它的性能優於可見光區域的光片顯微鏡，有望爲闡明腦神經網路的三維結構等做出貢獻。相關成果已發佈在Scientific Reports上。
圖1：X射線光片顯微鏡的構成與光片厚度測量結果（供圖：理化學研究所）
a）X射線光片顯微鏡的構成。利用全反射鏡反射X射線束並沿垂直度方向聚攏，形成細長的光片。用光片照射包含發紅色和綠色光的微小閃爍體的樣本，然後利用可見光顯微鏡系統從垂直度於X射線光軸的方向觀察這些發光。可以使用有彩顏色濾光片區分並觀察不同波長的發光。樣本沿淡藍色箭頭的方向平移。
b）光片的厚度。從X射線聚焦點出發，以幾條路徑沿光軸方向行程的同時進行刀口測量。橫軸表示X射線光軸方向的位置，縱軸表示光片厚度方向的位置，在這些坐標的各個點測量的X射線強度用輝度表示。
c）X射線沿b中的紅色箭頭和淡藍色箭頭的一維強度分佈。FWHM爲半峯全寬。
近年來，使用X射線的三維成像精度提高，被廣泛應用於各個領域。其中常用的是透過X射線的吸收和相獲得對比的X射線斷層掃描法（CT法）和透過散射獲得對比的相干X射線繞射顯微鏡法。這些方法需要旋轉樣本進行測量，並透過計算求取三維資訊，所以在獲取大樣本的三維資訊時，由於以高解析度觀察時視野會變窄，需要拼接資料，使得計算變得複雜。另外，對於1釐米左右的大型生物樣本中的微小組織，導入10奈米左右的金等微粒標記物進行觀察時，還存在難以獲得對比的問題。
作爲無需旋轉樣本即可觀察斷層影像的方法，研究人員開發了可見光區域的光片顯微鏡。光片顯微鏡設置了從樣本側面照射片狀激發光（光片），在與光片垂直度相交的方向觀察樣本中的螢光材料分佈的顯微鏡系統。透過使樣本垂直度於光片平移，無需計算即可獲得三維資訊。由於僅向進行螢光觀察的顯微鏡對焦的面照射光片，可以避免失焦影像在其他面重疊以及觀察面以外的額外輻射損害。然而，會存在樣本進深方向的解析度低於面内方向解析度的課題。
在可見光光片顯微鏡中，如果將決定進深方向解析度的光片厚度降至1微米以下，就需要先進的技術。另一方面，面内方向可以輕鬆達到200奈米左右的解析度，結合使用超解析度顯微鏡技術的話還能進一步提高，這樣進深方向與面内方向的解析度之間的不對稱會變得更加明顯，導致易用性變差。
作爲SYNAPSE（Synchrotrons for Neuroscience - an Asia-Pacific Strategic Enterprise）專案的一部分，國際聯合研究團隊開發了有望大幅減薄光片厚度的X射線區域的光片顯微鏡。
國際聯合研究團隊在SPring-8的理研光束線中構建了高解析度三維成像用X射線光片顯微鏡。構建的X射線光片顯微鏡透過用全反射鏡將X射線聚攏成片狀，利用刀口測量法應答光片的最小厚度爲65奈米。而且，使用20倍鏡頭時，即使是顯微鏡的視野（600微米見方）邊緣，厚度也小於300奈米。另外，向樣本中導入隨着X射線發光的閃爍體微粒後，結果顯示，可以透過寬視角的薄截面影像進行樣本進深方向解析度較高的三維成像測量。此次使用的全反射鏡適合將X射線聚光到最小尺寸，而且沒有色差。因此，無需將來自光源的非常強的X射線單色化，即使直接照射到樣本上，聚光尺寸（X射線光片的厚度）也仍然很小，有利於高速三維成像測量。
國際聯合研究團隊將此次開發的X射線區域光片顯微鏡命名爲MAXWELL（Microscopy by Achromatic X-rays With Emission of Laminar Light）顯微鏡。
MAXWELL顯微鏡將X射線用微螢光材料（尺寸爲10～20奈米的閃爍體）導入樣本中作爲標記物，僅照射光片的非常薄的截面產生螢光。利用與X射線光軸垂直度相交的可見光用顯微鏡來觀察螢光材料的二維分佈，透過使樣本沿光片厚度方向行程的同時拍攝影像來獲得三維分佈。
爲調查MAXWELL顯微鏡的解析度，研究團隊製作了在微細圖案上附着20奈米左右的量子點微粒的樣本。觀察結果顯示，可以分辨距離約爲400奈米的微粒，因此面内方向的解析度約爲400奈米，達到了繞射極限。另外還應答，進深方向的解析度約爲70奈米。這些結果表明，與可見光光片顯微鏡（進深方向的解析度爲數百奈米至1微米左右）相比，MAXWELL顯微鏡的解析度在進深方向具有壓倒性優勢，面内方向也達到了繞射極限。
在生物樣本的三維觀察中，厚度爲數十微米以上時需要進行透明化處理，但比這個厚度薄的話則不需要透明化處理。
MAXWELL顯微鏡面内方向的解析度爲達到繞射極限的400奈米左右，今後透過用超解析度顯微鏡法將其提高10倍左右，預計可實施各向同性高解析度三維成像。另外，透過使用低噪音相機，可以獲得單分子成像實驗所需的性能，作爲SYNAPSE專案主要研究物件的腦神經網路的三維結構等有望取得劃時代的科學發現。
原文：《科學新聞》
翻譯編輯：JST客觀日本編輯部
【論文資訊】
期刊：Scientific Reports
論文：The new X-ray/visible microscopy MAXWELL technique for fast three-dimensional anoimaging with isotropic resolution
DOI：10.1038/s41598-022-13377-w
