靜岡縣立大學藥學部生物化學領域的竹內英之教授、塚本庸平助教，名古屋大學研究生院醫學系研究科分子細胞化學領域的岡島徹也教授，東海大學醫學部醫學科基礎醫學機體防禦學領域的細川裕之副教授、鐮裕一助教等人的研究團隊與其他3所機構開展合作研究，在對細胞發育、分化具有重要作用的Notch受體上發現了一種此前未知的糖鏈修飾，並發現該糖鏈修飾能夠抑制Notch1信號。相關研究成果已發表在期刊《PNAS》上。
圖1 研究概要圖（圖片提供：靜岡縣立大學）
圖2 Notch受體與EGF模式圖（圖片提供：靜岡縣立大學）
Notch信號是在多細胞生物分化與發育過程中發揮重要作用的信號轉導通路。Notch信號由其他細胞表面的配體蛋白與細胞表面的大型受體蛋白NOTCH結合而啟動，最終透過改變基因表達將信號傳遞至細胞內。Notch受體功能不全可引發多種先天性疾病及癌症。
Notch受體的正常功能發揮，需要一種在其胞外區添加葡萄糖、岩藻糖等糖類的O型糖鏈修飾，但該修飾如何調控Notch受體功能，目前仍有諸多不明之處。
研究團隊利用基於液相色譜-質譜法（LC-MS）的最新分析手段，在Notch受體上發現了一種此前未知的糖鏈修飾，並闡明了其功能。
具體而言，研究團隊在添加於表皮成長因子樣（EGF）重複序列絲胺酸（S）殘基的O-葡萄糖（Glc）糖鏈中，發現了新型結構S-Glc-Gal-Neu5Ac。該結構作為醣脂的修飾糖鏈早已為人熟知，但作為醣蛋白的修飾糖鏈尚屬首次發現。
研究團隊依據質譜分析結果查明，這種新奇的糖鏈修飾僅存在於NOTCH1胞外區36個EGF重複序列中的第10個EGF重複序列（EGF10）上。研究發現，EGF10上的O-葡萄糖鏈既可透過既往已知的木糖延伸，也可透過新奇的半乳糖延伸。此外，團隊透過分析糖基轉移酵素缺陷細胞來源的糖鏈，鑑定出糖鏈生物合成所需的糖基轉移酵素。分析結果表明，負責為O-葡萄糖鏈延伸半乳糖的糖基轉移酵素為B4GALT1，而負責為經半乳糖延伸的O-葡萄糖鏈延伸Neu5Ac的糖基轉移酵素為ST3GAL4。
研究表明，上述糖基轉移酵素與在醣脂上生物合成Glc-Gal-Neu5Ac結構的酵素並不相同；即便糖鏈結構一致，醣蛋白與醣脂中參與生物合成的因子也存在差異。
研究發現，在不表達此前被認為必需的α-乳白蛋白的細胞「HEK293T細胞」中，O-葡萄糖鏈的半乳糖延伸能夠以B4GALT1依賴的方式進行。此外，研究還查明第396位氨基酸丙胺酸（A396）是半乳糖延伸過程中的重要氨基酸；將該位點替換為芳香族氨基酸酪氨酸（A396Y）或苯丙胺酸（A396F）時，O-葡萄糖糖鏈的半乳糖延伸會消失。
研究同時闡明了新型糖鏈修飾對Notch信號的影響。研究團隊利用A396位點突變體、糖基轉移酵素基因缺陷細胞及糖基轉移酵素基因過表達細胞，製備出糖鏈修飾各異的Notch蛋白，以此探究糖鏈修飾的功能。使NOTCH1重組蛋白與配體表達細胞相結合後發現，木糖延伸促進配體結合，半乳糖延伸抑制配體結合。研究進一步檢測了表達全長NOTCH1重組蛋白的細胞經配體重組蛋白刺激後產生的Notch信號強度。結果顯示，與未突變的野生型NOTCH1相比，缺失半乳糖延伸的A396Y、A396F突變體信號轉導增強。
最後，研究團隊在已知依賴Notch信號分化為T細胞前驅物的小鼠淋巴細胞前驅細胞中，分別過表達野生型NOTCH1以及A396Y、A396F突變型NOTCH1，與配體表達細胞（OP9）共培養以誘導分化。該淋巴細胞前驅細胞（Cas9-LPs）缺失B細胞前驅物分化所必需的EBF1基因，僅能依賴Notch信號分化為T細胞。結果顯示，與表達野生型NOTCH1的淋巴細胞前驅細胞相比，表達缺失半乳糖延伸突變體的淋巴細胞前驅細胞向T細胞的分化受到極強促進。
該成果可推動新藥研發
綜合上述結果可知，半乳糖延伸抑制NOTCH1與配體的結合，木糖延伸則促進該結合；其結果是，無半乳糖延伸時Notch信號轉導得到促進。研究提示，若該現象發生在淋巴細胞前驅細胞中，NOTCH1信號增強會大幅促進其向T細胞分化。
研究明確，僅僅一處氨基酸的差異就能大幅改變糖鏈結構，進而調控對多細胞生物極為重要的Notch信號。該研究不僅作為糖鏈生物學領域的基礎研究拓展了糖鏈修飾多樣性的概念，也被認為從一般生物學層面揭示了Notch受體調控機制的重要一面。未來，該成果有望持續推動以糖鏈修飾為靶點、旨在調控Notch信號的新藥研發。
原文：《科學新聞》
翻譯：JST客觀日本編輯部
【論文資訊】
期刊：ＰＮＡＳ
論文：Differential O-glucose elongation on a specific EGF repeat within the canonical ligand-binding domain regulates DLL1/4-NOTCH1 signaling
DOI：10.1073/pnas.2504827122
