最尖端的科學技術，正開始清晰地捕捉此前無法看到的身體和大腦的微觀世界。本特集將介紹「時間精確定格冷凍光學顯微鏡法」——通過冷凍定格細胞的「決定性瞬間」，以高解析度觀察毫秒級的快速生命現象。此外，本文還將介紹利用光遺傳學等技術闡明了負責記憶和識別他人的神經細胞的功能，探索了自閉症譜系障礙以及共情機制的奧秘，以及探尋人體全新視覺化技術所開創的未來。
自16世紀後期光學顯微鏡發明以來，人類得以觀察到此前因尺寸太小而無法看見的事物，科學由此取得了巨大發展。此後，根據不同的目的，各種類型的顯微鏡被相繼開發出來，時至今日，開發的熱情絲毫未減。大阪大學研究生院工學研究科的藤田克昌教授在全球首次開發出的「時間精確定格冷凍光學顯微鏡法」，能夠在目標時間點瞬間停止細胞活動並進行觀察，有望在生命科學、醫療及新藥研發等眾多領域得到應用。
藤田克昌
大阪大學研究生院工學研究科教授
2019～2024年 CREST研究負責人
讓細胞停止活動，在弱光下仔細觀察
轉換研究思路，兼顧定量性和解析度
生物細胞內部的狀態每時每刻都在發生變化。為了觀察細胞是如何活動的，研究人員為了捕捉其真實面貌，一直在不斷挑戰。憑藉光學顯微鏡這種「最強武器」之一，迄今為止已闡明了多種生命現象。
螢光顯微鏡作為光學顯微鏡的一種，被廣泛運用於在分子水平上觀察細胞內部的狀態。它通過檢測樣本在光照下發出的螢光，來視覺化分子的狀態。其優點是可以高對比地選擇性觀察目標；但另一方面，為提升時間解析度而縮短光照時長，會導致可檢測到的螢光量下降，進而出現定量性和空間解析度下降的問題。
在細胞內，離子濃度的變化以毫秒（ms，毫為千分之一）為單位傳遞。為了捕捉瞬間的狀態變化而縮短光照時間，會導致樣本發出的光量不足，畫面充滿噪聲。另一方面，如果為了彌補光量不足而使用雷射等強光，又會因高溫造成細胞死亡。
也有使用福爾馬林或酒精類化學試劑停止細胞活動後進行觀察的方法。但停止活動需要數分鐘以上的時間，很難觀察到特定瞬間的細胞狀態。此外，使用化學試劑還存在會導致細胞狀態和離子分佈發生變化的問題。
觀察特定瞬間細胞的真實狀態——說起來簡單，但此前一直存在難以逾越的技術壁壘。為了解決這一課題，許多研究人員致力於開發拍攝速度更快的顯微鏡，但大阪大學的藤田克昌教授卻轉換了思路。他設想，如果能夠瞬間停止細胞的活動，之後即使用弱光也可以長時間仔細觀察，這樣不就能兼顧時間解析度和空間解析度了嗎？
向樣本直接滴加液體冷凍劑
瞬間凍結細胞後進行觀察
藤田教授為停止細胞活動，選擇的是冷凍樣本的方法。然而，要將含水量高的細胞以原有狀態進行冷凍並非易事。最大的阻礙是冰晶。水在凍結時會形成尖銳的結晶，從內外破壞細胞。
作為一種不損傷細胞微細結構即可實現冷凍的方法，可以使用極低溫液體冷凍劑。
使用液化氣體丙烷或異丁烷等液體冷凍劑對細胞進行急速冷卻時，水分子在規則排列之前就以隨機狀態凍結。這樣細胞內就不易形成冰晶，可以在不破壞細胞的情況下將其冷凍。
然而，這一嘗試並非一帆風順。最初，研究人員是先在別處冷凍細胞樣本，然後再移送至顯微鏡載物臺觀測，但實驗並不順利。因為在細胞樣本的移動過程中，即使能將樣本保存在液氮中的極低溫環境，在放到顯微鏡載物臺上時也依舊不可避免地會升溫。只要樣本溫度稍有上升，細胞的一部分就會融化，水分子移動從而形成冰晶。此外，空氣中的水分也會瞬間凍結，形成冰霜覆蓋樣本。
在反覆試錯的過程中，藤田教授某天意識到「樣本先冷凍後再轉移至顯微鏡」這一固有認知束縛了研究。他萌生了全新構想：在顯微鏡下觀測細胞的同時直接急速冷凍細胞。
於是，研究團隊將盛放細胞樣本的容器（樣本室）放置在載物臺上，開發了一種將液體冷凍劑直接滴加到樣本上的裝置，成功開發出了瞬間冷凍樣本細胞並進行觀察的方法（圖1）。液體冷凍劑採用-185℃的液態異戊烷和液態丙烷混合物。盛放樣本的樣本室選用了即使在滴加液體冷凍劑的瞬間承受急劇溫差也不會破損、且易於保持低溫的材料，用3D列印機自制而成。只要準備好備用的樣本室，更換觀察樣本僅需約1分鐘。
圖1 為在顯微鏡載物臺上急速冷凍細胞樣本而開發的樣本室截面圖及實物照片。在滴加-185℃的液態異戊烷和液態丙烷混合而成的液體冷凍劑之前，先用移液器減少緩衝液，以提高樣本的冷卻效率。
此外，通過電動控制，可以以±10ms的精度將液體冷凍劑滴加到樣本上，在指定時間點凍結細胞。「時間精確定格冷凍光學顯微鏡法」由此誕生，它能夠根據需要定格細胞的時間，然後長時間仔細地進行觀察。「冷凍（Cryo）」源自希臘語，意為「冰」、「低溫」。
對瞬間活動可觀察長達10秒
拍攝細胞內傳導的Ca2+
藤田教授等人利用該裝置，成功地對大鼠心肌細胞內高速運動的鈣離子（Ca2+）以及細胞內動態運動的胞器等進行了瞬間冷凍固定及觀察。Ca2+在細胞內承擔著傳遞各種信號的作用，其濃度隨細胞活動而變化。由於Ca2+運動速度極快，既往觀察方法只能照射短短10ms的光線。
藤田教授等人使用開發的裝置對大鼠心肌細胞進行急速冷凍後，Ca2+的運動如期停止（圖2）。以往轉瞬即逝的細胞活動，現在可以照射長達10秒的光進行觀察，觀測時長是既往方法的1000倍。結果，代表圖像清晰度的信噪比從8.9提升至340，獲得了解析度極高的圖像（圖3）。此外，研究還證實，從細胞內現象發生到冷凍固定的時間可以以±10ms的精度任意設定。
圖2 Ca2+在大鼠心肌細胞內傳導的過程。為進行拍攝，向細胞內導入了在Ca2+濃度高時會發光的螢光性Ca2+指示劑。常溫下Ca2+從圖像左上向右下高速傳導，但投入液體冷凍劑進行冷凍固定後傳導停止（右二），200ms後依然維持該狀態。
圖3 常溫下曝光10ms拍攝的圖像（左）與冷凍固定後曝光10s拍攝的圖像（右）。冷凍固定後，拍攝時長較常溫時提升1000倍以上，因此可獲得噪聲更低、更清晰的圖像，實現定量性更高的觀察。
利用此次開發的「時間精確定格冷凍光學顯微鏡法」，就能夠針對同一時間點的細胞狀態，藉助多種所需觀測時長各不相同的光學顯微鏡技術進行詳細觀察。通過對隨時間推移分佈和狀態發生動態變化的細胞生命現象和細胞響應進行高定量性、高空間解析度的視覺化，「或許能夠為生命科學、疾病機制的闡明和藥物研發帶來全新見解」——藤田教授對此寄予厚望。
同樣應用於「拉曼顯微鏡」
實現既往方法8倍的亮度
藤田教授等人還在推進將生物樣本急速冷凍的方法與各類顯微鏡相結合的相關研究。拉曼顯微鏡便是其中之一。它通過檢測照射光被樣本分子反彈時產生的「拉曼散射光」，來視覺化樣本中所含分子的種類和結構。
由於拉曼散射光極其微弱，想要檢測低濃度物質或提高信噪比，就需要對生物樣本照射強雷射。但這樣做可能會使樣本損傷或改變其狀態，因此過去普遍認為不適用於細胞觀察。
藤田教授從20多年前就開始從事拉曼顯微鏡的開發，致力於提升測量的靈敏度和速度。他還曾參與大阪大學創辦的新創企業Nanophoton（大阪府箕面市），將自主開發的拉曼顯微鏡產品化。通過將在此積累的技術與細胞急速冷凍觀察技術相結合，開發出了適用於細胞觀察的「冷凍-拉曼顯微鏡」（圖4）。在抑制樣本損傷和狀態變化的同時，實現了利用拉曼顯微鏡對細胞進行觀察。
圖4 「冷凍-拉曼顯微鏡」的樣本週邊示意圖。將培養有細胞的蓋玻片放置在樣本架上，並接觸金屬板。注入的液體冷凍劑通過金屬板的孔接觸樣本，使細胞急速冷凍。通過流經金屬板內部的液氮和加熱器進行精密溫度控制，使細胞保持穩定狀態，也不易發生熱引發的分子振動。
「冷凍-拉曼顯微鏡」通過耗時收集微弱的拉曼散射光，能夠以比既往方法更高的靈敏度檢測細胞內的分子。實驗證實，與既往方法相比，可獲得約8倍的拉曼散射光（圖5）。
圖5 用「冷凍-拉曼顯微鏡」觀察冷凍固定的培養細胞的圖像。觀察時長約10小時。圖像中綠色表示細胞色素，紅色表示脂質，藍色表示蛋白質的分佈。
使用拉曼顯微鏡進行觀測時無需對樣本進行染色，能夠直接視覺化細胞未發生狀態與功能改變時的原始樣貌。藤田教授滿懷期待地表示：「以往的觀察是對預先標記好的‘目標觀察對象’進行確認的操作，而我們開發的「冷凍-拉曼顯微鏡」能夠非破壞性地讀取樣本整體的資訊。所得資料中，或許隱藏著意想不到的發現」。
為了解「活細胞」學醫
真實「描繪」生命的姿態
藤田教授運用各種光學現象，致力於開發讓原本不可見的事物變得可見的顯微鏡技術，但他並非從一開始就立志研發顯微鏡。他笑著回憶道：「我在確定畢業論文課題的討論會時遲到了，剩下可選的課題恰好就是顯微鏡」。當時的主流方向是將具有高能量的電子束照射到樣本上進行觀察的電子顯微鏡。然而，藤田教授通過巧妙調控光的波長與特性，逐漸沉浸於電子顯微鏡無法實現的「活細胞所蘊含的資訊」的觀察。
博士結業後，為了加深對觀察對象——「活細胞」的理解，他以博士研究員的身份進入京都府立醫科大學的病理學教研室。由於他此前一直在工學部從事研究，幾乎沒有醫學知識，那段日子可謂艱苦卓絕。他回顧道：「完全看不懂論文的內容，讀完一篇論文需要花費很長時間。感覺就像回到了大學一年級」。
然而，通過親自培養細胞進行實驗，他積累了只有通過實踐才能獲得的經驗，也逐漸理解了生物學家和醫師們出於何種理由、想要觀察什麼以及希望如何觀察。進而也明白了為了滿足這些需求，需要開發什麼樣的顯微鏡。
在全球頂尖研究人員激烈角逐的環境下，藤田教授沒有追隨聚集大量研究人員與資金的熱門研究課題，而是堅持以獨到視角開拓全新研究領域的立場。以急速冷凍活細胞、捕捉「決定性瞬間」這一獨特思路，力求生動還原生命的真實樣貌，其背後的驅動力，正是「究竟能看見什麼」的好奇心，以及敢於質疑並突破常識與固有認知局限的自由思維。
（TEXT：安藤鞠、PHOTO：松井Hirosi）
原文：JSTnews 9月號
翻譯：JST客觀日本編輯部
