京都大學研究生院工學研究科的浜地格教授（研究當時職稱，現為該校能源理工學研究所特任教授）、田村朋則副教授、Fatima Yuri Tanimura Valor博士生等人，著眼於能夠穿過細胞膜的單線態氧，利用固定在細胞外側的光敏化劑所產生的單線態氧，開發出了同時標記膜蛋白細胞內外鄰近蛋白的transmembrane PhoxID（tmPhoxID）新技術。研究團隊將該技術應用於活體小鼠腦內的神經遞質受體後，成功鑑定了受體周圍存在的蛋白質群，並發現了透過突觸連接神經細胞間的分子網絡以及此前未知的相互作用。作為一舉解析膜蛋白細胞內外分子網絡的全新研究基礎，有望廣泛應用於神經科學等生命科學研究。相關成果已發表於《Nature Communications》。
圖1 tmPhoxID的原理（圖片提供：京都大學）
首先，使用奈米抗體或小分子探針將光敏化劑靶向至靶跨膜蛋白的細胞外區域。隨後，在膜透過性生物素標記劑存在下，照射綠色光（520nm）激發光敏化劑，產生單線態氧（¹O₂）。¹O₂穿過脂質雙層膜，氧化跨膜蛋白細胞內外的鄰近蛋白。這些被氧化的鄰近蛋白與生物素標記劑反應，從而被生物素修飾。將生物素修飾的蛋白質用親和素磁珠純化、濃縮，製成肽片段後，進行質譜分析，即可鑑定鄰近蛋白質。
此前，解析跨膜蛋白質相關分子網絡時，廣泛採用將免疫沉澱與質譜分析相結合的IP-MS法，但其空間解析度和時間解析度不足，難以捕捉局部、瞬時發生的相互作用。因此，鄰近標記法被廣泛使用，但所用的高反應性分子大多無法穿透細胞膜，所以只能解析細胞內外某一側的相互作用蛋白。
研究團隊應用此前開發的PhoxID，確立了能夠跨越細胞膜進行鄰近標記的tmPhoxID新方法。tmPhoxID首先使用低分子抗體（奈米抗體）或小分子探針，將光敏化劑靶向至靶跨膜蛋白的細胞外區域。隨後照射綠色光（520奈米）激發光敏化劑，產生單線態氧。單線態氧壽命短（半衰期約數百奈秒）、擴散性極高，能夠跨越脂質雙層膜，因此可選擇性地氧化跨膜蛋白細胞內外的鄰近蛋白。這些被氧化的蛋白質被膜透過性高的生物素標記劑修飾，並進行質譜分析，即可系統性鑑定靶跨膜蛋白細胞內外的鄰近蛋白。
研究團隊將新開發的tmPhoxID應用於活體小鼠腦內，調查神經細胞表達的各種神經遞質受體周圍富集的蛋白質。將該技術應用於定位於小腦興奮性突觸後膜的GluD2受體後，除GluD2的細胞外相互作用蛋白之外，還檢測到了已知與GluD2特異性相互作用的細胞內（突觸後膜內）蛋白質。此外還發現，突觸前側與神經傳遞物質釋放相關的細胞內蛋白質也能被檢測出來。
該結果顯示，該技術有望全面檢測近年來作為高效進行突觸傳導的機制而提出的「跨突觸奈米柱」的構成蛋白。
接下來，研究團隊將tmPhoxID應用於定位於抑制性突觸後膜的GABAAR。結果顯示，與靶向定位於興奮性突觸後膜的GluD2的實驗不同，檢測到了定位於抑制性突觸的細胞內蛋白質群，表明tmPhoxID具有突觸級別的空間解析度。此外，透過比較同一興奮性突觸中存在於不同位置的GluD2與mGlu1，發現tmPhoxID能夠區分非常鄰近位置上的蛋白質差異。
此外，分析GABAAR周圍存在的蛋白質後，發現了此前未知的GABAAR與CAMKV蛋白質之間的相互作用。該相互作用不僅在小鼠腦中，在人類死後大腦中也得到確認。GABAAR與CAMKV的相互作用在神經科學上具有怎樣的功能和意義尚不清楚，今後將進行更詳細的探討。
田村副教授表示：「本項目始於此前推進PhoxID開發的高遠同學在畢業前觀測到一個意料之外的結果——反應似乎跨越了細胞膜。之後的研究曾一度難以重現結果、進展停滯，但來自西班牙的留學生Tanimura堅持研究，找到了最合適的生物素化劑，之後研究才得以快速推進，最終順利完成論文。」
原文：《科學新聞》
翻譯：JST客觀日本編輯部
【論文資訊】
期刊：Nature Communications
論文：Transmembrane PhoxID: Photoproximity labelling across the plasma membrane in vivo
DOI：10.1038/s41467-026-78135-2
