理化學研究所（理研）生命機能科學研究中心整合生物元件研究團隊的田中陽首席研究員、太田亙俊研究員，與北海道大學的與那嶺雄介助教、東京大學大學院的小關泰之副教授、九州大學的星野友準教授等組成的聯合研究小組，透過精巧設計的「水壩型」微流體玻璃晶片，成功對可泳動微生物在晶片微通道中進行了分離和培養，並對每一個細胞的長時間觀察來實施了多個細胞代謝產物的測定 [1]。
基於該技術，對以前難以持續觀察的快速泳動型微生物的示蹤變得可能，同時也可以用於生物燃料、營養補充劑、生物藥等特定次級代謝產物生產用途的微生物篩選等（圖1）。該研究成果已線上發表於2019年7月8日的《Analytical Chemistry》上[文獻1]。
圖1 玻璃微流體晶片中實施單細胞分離、培養和觀察
在同一類微生物群體中，不同個體間產生某種目的代謝產物的能力差異性極大。所以在研究實驗室或者工業生產中，往往需要先富集篩選出能夠產生某種目的代謝產物的高產菌株（細胞株）。目前針對不同微生物和不同目的次級代謝產物，有各種各樣的篩選方法。其中非侵入性檢測代謝產物的拉曼光譜術，是對細胞内代謝產物變化即時觀測的重要手段之一。
代謝分析一般需要將單個細胞一一擷取，然後在其生長期間進行；尤其對於那些運動快速的微生物，還需要保證其在重複觀測期間不能跟丟。如果爲了便於追蹤簡單的將被觀測微生物封閉在狹小的空間内，由於缺乏新鮮的細胞培養液供給，往往會導致個體代謝異常。所以之前對於具有快速運動能力的微生物很難進行長達數小時的即時觀測。
本次研究組選取的實驗物件是具有鞭毛能快速遊動的單細胞眼蟲（Euglena）。眼蟲細胞內能夠透過光合作用合成生物燃料成分之一--裸藻澱粉（Paramylon）。裸藻澱粉是由成百上千個葡萄糖單體透過β-1,3鍵結合而成的多醣類物質。當在眼蟲細胞内大量合成累積時，可以見到顆粒狀的結構體。在厭氧狀態下，眼蟲會將裸藻澱粉轉化成油脂類獲取能量。要篩選眼蟲中裸藻澱粉的高產株系，必須對每一細胞的裸藻澱粉同化代謝情況進行測定（圖2）。
圖2 微流體玻璃晶片實物照片
微流體晶片是透過使用半導體製造技術，在樹脂或者玻璃等基底層上製出精細通道，對液體或者液體中的流動粒狀物進行分離、濃縮、反應、分析等操作的微型整合裝置。該研究組先利用玻璃材料製備了0.9毫米厚的微流體晶片，晶片微通道中蝕刻有水壩型的結構。然後透過連續貫流的細胞培養液，行動敏捷的眼蟲被逐一滯留在壩型結構的邊緣併成功持續培養。
爲了製備同時能夠實施分離與培養功能的壩型結構，研究組首先用氟化氫對0.7毫米厚的玻璃基底層進行蝕刻，基底層表面形成126條細胞分離用精細通道。壩型結構上方預留了1微米高的間隙用於培養液的更替，最後再貼覆另一層0.2毫米厚的玻璃基底層（圖3）。透過調整細胞培養液的流速和方向，可以實施精細通道中眼蟲的分離及過剩微生物的去除。
圖3 微流體玻璃晶片各製作參數
當細胞培養液的流速爲每分鐘5微升時，眼蟲可以在精細通道的末端即壩型結構前滯留下來；此時每條通路不多於兩個細胞，一枚晶片大約有25-35個眼蟲單體被成功分離；然後調整培養液的流速爲每分鐘1微升連續供給，眼蟲得到原位持續培養。進一步結合非侵入性的拉曼光譜分析法，對眼蟲胞内產生裸藻澱粉的代謝程序進行了即時測定（圖4）。
圖4 拉曼光譜術觀測分析眼蟲活體內裸藻澱粉的積聚
供稿 宋傑 東京大學博士
圖取自日文新聞發佈稿
編輯修改 JST客觀日本編輯部
參考文獻：
1. Nobutoshi Ota, Yusuke Yonamine, Takuya Asai, Yaxiaer Yalikun, Takuro Ito, Yasuyuki Ozeki, Yu Hoshino and Yo Tanaka. Isolating single Euglena gracilis cells by glass microfluidic for Raman analysis of paramylon biogenesis. Analytical Chemistry. DOI 10.1021/acs.analchem.9b01007
相關鏈結：
1. 東京大學官網新聞稿
