科學研究 - 日本開發出利用光來高密度濃縮微生物活體的蜂窩基底層

日本大阪府立大學LAC-SYS研究所在JST的未來社會創造專案中，成功開發出了無需培養，就可在照射雷射的條件下低傷害（80～90％存活率）高密度地濃縮生物樣本的「蜂窩型光濃縮基底層」。

圖：只需向蜂窩狀微孔基底層照射數十秒的雷射，就能「大面積」、「高密度」和「高生存率」擷取有用細菌

該研究受具有自然界最密集的六方體「蜂窩」啓發，開發出了擁有與微米級細菌配對分組的中孔並賦予光發熱特性的高分子膜蜂窩基底層。透過對大量活細菌進行高密度光濃縮，全球率先成功強化了基底層上細菌整體的代謝功能。這項成果將大大促進生質利用技術的創新。

＜研究背景＞

除了對目標細菌的代謝機制進行基礎評價外，從有用細菌的應用和功能最大化的角度來說，對細菌進行活體高密度富集也非常重要。近年來，有用細菌代謝機制的應用非常廣泛，包括污水處理、生物乙醇等有用有機化合物的純化，以及電能的獲取等。例如，已知原始細菌地桿菌屬和希瓦氏菌屬等發電菌會將菌活體內氧化還原反應產生的電子有效排放到菌體外，在微生物燃料電池（MFC）領域的應用備受期待。很多研究都在利用這種電子行程機制，設法提高從發電菌獲取電子的效率。例如，爲增加接觸面積，開展了利用多孔碳和石墨烯奈米帶等表面積較大的電極的研究，但要採用培養法增加細菌的密度，則需要花費數天以上的時間。

細菌的尺寸從幾百奈米（nm）到數微米（μｍ）不等。研究團隊認爲，如果能製備密集排列1～10μｍ左右中孔的基底層，就可以使接觸面積最大化。透過在外場遠程將大量活細菌擷取到基底層上，應該可以實施功能最大化。對於擷取細菌的基底層，研究團隊將目光放到了在自然界擁有最密集的六方最緊密堆積結構的蜂窩結構上。需要確保單位面積的體積和強度的器官都採用了大型蜂窩結構，例如包括能以很少的材料貯藏大量蜂蜜的蜂窩、增加表面積以感知大量光的昆蟲複眼，以及分散來自各個方向的應力得以保存身體的龜殼等。業界也在嘗試開發利用蜂窩結構的仿生技術。同時，外場的細菌擷取技術也存在的挑戰。採用像光鑷那樣利用與光電磁場之間的相輔作用的方法只能擷取少量細胞，而採用光發熱集合法（應用向金屬奈米薄膜照射光時產生的光發熱效應形成的對流）的話，大部分細菌都會死亡。

研究團隊從蜂窩結構的這種優異特性和外場細菌擷取技術獲得啓發，在基底層上製作了具有適合微米級細菌的中孔的蜂窩高分子膜。透過設計光發熱效應的導熱特性，試着研究了利用物理可用能手段以低傷害快速高密度擷取大量「活」細菌的原理（圖1）。

圖1：利用蜂窩基底層來高密度地光濃縮活菌

＜研究方法＞

研究團隊透過以水滴爲鑄模在聚合體膜中自組織形成蜂窩狀中孔，並在其表面形成金屬奈米膜（膜厚爲50nm），開發出了高效率的光發熱基底層。向蜂窩基底層的隔膜部分照射紅外雷射（波長爲1064nm）產生「光誘導對流」，聚集有鞭毛且具備趨化性的銅綠假單胞菌和不具備趨化性的金黃色葡萄球菌，來評估存活率。另外，作爲光整合物件，透過改變雷射照射點的數量還可聚集發電菌。然後透過測量向蜂窩基底層施加電壓產生的電流密度，對其功能進行了評價。熱視覺測量顯示，照射相同輸出功率的雷射時，與塗覆以往的光發熱集合法採用的平面金奈米薄膜的基底層相比，蜂窩基底層的溫度會加倍升高（圖2）。此外，研究團隊還結合電磁響應理論和熱流體力學理論解析了對流。結果顯示，蜂窩基底層表面會產生朝向雷射照射點的水平對流，而中孔内則產生渦狀對流，由此驗證了活細菌也能被高密度擷取（圖1B右）。

圖2：蜂窩基底層與以往的平面基底層的光發熱效果比較

＜研究成果＞

下面介紹一下利用蜂窩光濃縮基底層，透過雷射照射擷取細菌的結果。目標細菌採用了革蘭陰性菌——銅綠假單胞桿菌和革蘭陽性菌——金黃色葡萄球菌。圖1C上方是以40ｍW的雷射輸出在蜂窩高分子膜上進行光發熱集合時的活菌（綠色）和外膜受損細菌（紅色）的螢光示意圖。從圖中可以看出，細菌在高達100μｍ的大範圍内密集地聚集在蜂窩高分子膜上，幾乎沒有死菌（紅色）。另外還應答，照射雷射後將聚集了細菌的基底層浸入培養液中培養時，細菌會增殖。作爲對照實驗，向利用常規方法製作的平坦金屬奈米平面基底層照射雷射發現，使用70ｍW以下的雷射不會產生氣泡，而照射129ｍW的高功率雷射時，細菌雖然聚集到了雷射照射點附近，但聚集範圍比較小，存活率也只有約16％，大部分細菌均死亡。圖3是在10ｍW～70ｍW的範圍内改變照射各細菌的雷射功率，根據擷取的細菌的螢光染色影像估算擷取密度與存活率的關係。可以看出，銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌在特定的雷射功率範圍内均能保持80～90％的高存活率，並被高密度擷取到各蜂窩中孔中。

圖3：多種細菌的光整合擷取密度與存活率

爲評估高密度擷取的細菌功能，研究團隊以發電菌之一的希瓦氏菌爲物件進行了實驗。圖4是以光整合這種細菌的蜂窩基底層爲負極，以Pt基底層爲正極，以Ag/AgCl爲參比電極的三電極系統中邊裝載偏壓邊測量電流。已知希瓦氏菌會分解有機物質釋放電子，因此添加乳酸鈉作爲有機物質，在易於提取電子的厭氧條件下進行了測量。向各個點依次照射20秒的雷射發現，照射點的數量增至25點、50點和100點的話，電流密度會隨着照射點數增加1～2位數。研究團隊在不會引起細胞分裂的短時間内測量了電流，電流密度的增大被認爲是隨着雷射照射而高密度聚集的希瓦氏菌引起的。