科學研究 - 理研開發出類似指紋認證的癌症標記技術，有望開發活體內癌組織的新診斷方法

日本理化學研究所（簡稱「理研」）的主任研究員田中克典和特別研究員野村昌吾等人組成的研究團隊，透過在細胞上合成人工醣肽，成功地像指紋認證一樣對癌細胞進行了圖形辨識，並利用該模式標記了小鼠活體內的特定癌組織。

圖1：左起分別爲田中克典主任研究員和野村昌吾特別研究員

2017年，田中主任研究員等開發了利用RGDyK肽與細胞表面的整合素之間「強」相輔作用，以及糖鏈與接受者凝集素之間「弱」相輔作用的細胞識別技術。

此次，研究團隊對該項技術進一步開發，發現透過組合4種RGDyK肽和5種糖鏈，並利用點擊反應在細胞上合成人工醣肽，能對5種癌細胞和1種非癌細胞進行圖形辨識。另外，團隊還利用建立的圖形辨識了小鼠活體內的癌組織，成功高靈敏選擇性地識別出特定的癌組織。

圖2：組合2種分子辨識靶細胞

研究背景

人和動物等活體內分子成像作爲選擇性識別抗癌藥物的活體內動態和特定細胞的診斷方法備受關注。以往的分子成像廣泛使用與目標識別的靶細胞表面表達的1種接受者「強」相輔作用的低分子化合物、抗體及肽等配體分子。

但利用「強」相輔作用的配體分子的話，由於其與靶細胞以外的細胞中表達的接受者也會「強」相輔作用，因此從大量細胞中選擇性地識別靶細胞的能力有限。例如，想利用「強」相輔作用的配體分子。從表達相同種類接受者的細胞A和B中僅選擇性地識別細胞A時，由於配體分子與細胞A和B的接受者都會相輔作用，因此很難區別兩種細胞（圖3a）。另外，利用「弱」相輔作用的配體分子的話，即使與接受者相輔作用也會立即分離，所以無法以高靈敏度進行檢測（圖3b）。

2017年，田中克典主任研究員等人開發了從HeLa細胞（人宮頸癌細胞）中識別正常細胞HUVEC（人臍帶上皮細胞）的高靈敏細胞識別技術（圖3c）。該技術讓具備某種反應性官能基的「強」相輔作用配體分子（肽配體）與細胞表面上的接受者進行第一次相輔作用後（預靶向），再讓「弱」相輔作用的配體分子（糖鏈配體）與其他接受者進行二次相輔作用。選擇性結合預靶向官能基的反應性官能基及標記基團與糖鏈配體結合。進行第二次相輔作用時，肽配體與糖鏈配體結合的點擊反應僅在這兩種配體分別相輔作用的兩種接受者所在的細胞A表面進行。由此會生成人工醣肽，可以透過糖鏈配體的標記基團選擇性地檢測細胞A。

圖3：以往的靶細胞識別方法與本次研究開發的方法

a:利用「強」相輔作用的配體分子時，即使與細胞A相輔作用的接受者大量表達，但由於會同時識別細胞A和B二者的接受者，所以也很難進行區分。

b:利用「弱」相輔作用的配體分子時，即使與接受者相輔作用也會立即分離，因此無法以高靈敏度進行檢測。

c:依次利用「強」相輔作用和「弱」相輔作用，並透過點擊反應使這些配體分子在靶細胞表面結合，可以選擇性地識別靶細胞。

研究方法與成果

研究團隊爲推廣先前開發的細胞識別技術，準備了4種「強」相輔作用的肽配體和5種「弱」相輔作用的糖鏈配體。然後將其應用於5種癌細胞（HeLaS3：人宮頸癌細胞、A549：人肺泡基底上皮腺癌細胞、BxPC3：人胰腺癌細胞、PC3：人前列腺癌細胞、SW620：人結腸癌細胞）和1種非癌細胞（TIG3：人二倍體纖維母細胞）（圖4）。

圖4：「強」相輔作用的肽配體與「弱」相輔作用的糖鏈配體的設計

αvβ3整合素接受者的配體分子RGDyK肽單元（1a～1d）、凝集素接受者的配體分子N型糖鏈單元（2a～2e）及標記基團的結構。

採用的6種細胞都表達與RGDyK肽配體「強」相輔作用的αvβ3整合素接受者。僅透過以前的「強」相輔作用識別細胞時，所有細胞都會檢測出強烈的熒燈火信號，無法識別這些細胞（圖5右上方的框内）。

而利用此次開發的方法，透過組合「強」相輔作用和「弱」相輔作用的2種配體，成功對癌細胞和非癌細胞進行了圖形辨識（圖5）。例如，透過爲HeLaS3細胞採用末端具有N-乙酰葡糖胺或甘露糖的糖鏈配體（2d、2e），爲A549細胞採用末端具有α（2、3）口水酸的糖鏈配體（2b），爲BxPC3細胞採用末端具有半乳糖、N-乙酰葡糖胺或甘露糖的糖鏈配體（2c、2d、2e），成功標記了各細胞。

圖5：利用RGDyK肽配體和N型糖鏈配體選擇性標記細胞

如a～f各細胞的右上方框内所示，僅利用以往的「強」相輔作用配體無法識別細胞。而利用預靶向法，可透過組合特定配體獲得的熒燈火信號模式來識別細胞。

此外，研究團隊還將該方法應用於活體內癌組織識別。針對種植性轉移了HeLaS3細胞（人宮頸癌細胞）或A549細胞（人肺泡基底上皮腺癌細胞）的小鼠，首先注射「強」相輔作用的RGDyK肽配體（1d）進行預靶向，30分鐘後再注射「弱」相輔作用的糖鏈配體（3b或3d）標記癌組織（圖6a）。此時，標記基團使用可透過近紅外光線進行標記的Cy7.5。最終，源自HeLaS3細胞的癌組織利用糖鏈配體（3d），源自A549細胞的癌組織利用糖鏈配體（3b）檢測到了強烈的熒燈火信號，成功地選擇性識別了癌組織（圖6b、c）。