京都大學iPS細胞研究所（CiRA）的特定研究員趙成珠和池谷真副教授的研究團隊，京都大學研究生院醫學研究科整形外科的光澤定己研究生、池口良輔副教授和松田秀一教授的研究團隊，以及京都大學研究生院醫學研究科人類健康科學的青山朋樹教授、佐賀大學醫學部再生醫學研究中心的中山功一教授和Cyfuse公司的代表董事秋枝靜香透過開展聯合研究，驗證了利用人工富潛能幹細胞（iPS細胞）源間充質幹細胞（iMSC）製備的生物3D神經導管對末梢神經再生的有效性和機制。
研究團隊將免疫缺陷大鼠的坐骨神經切斷5mm進行了驗證，雖然在作爲生物3D神經導管移植的對照組使用的矽膠管移植中，切斷的神經也在術後8周實施再生，但對形態、運動性、電生理學和肌肉重量進行評估發現，生物3D神經導管移植組的再生神經明顯處於優勢。另外，在移植的生物3D神經導管的内側和表面都觀察到了新生血管，應答iMSC的皮下移植具有促進血管新生的功能。
以上結果表明，利用iMSC製備的生物3D神經導管能有效實施末梢神經再生，將來有望爲臨牀應用做貢獻。
研究背景
外傷和腫瘤切除經常會傷害末梢神經。在可以縫合的情況下，一般透過縫合切斷處進行開墾，無法縫合時，最標準的冶癒方法就是自體神經移植。移植的神經是軸突成長的最佳支架，能幫助開墾受損的神經。不過，自體移植存在一些潛在的缺點，比如採集部位傳染、供給量有限、會形成神經瘤、口徑不一致、需要額外做外科手術以及手術時間增加等。
異體神經移植雖然能解決其中一些缺點，但需要在圍手術期進行免疫抑制以及妥善保管採集的神經等。人工神經導管是第三個選項，已經實際用於臨牀。據報告，人工神經導管的支持細胞、支架、成長因子和血管生成能力等已得到改善，但由於使用人工材料，存在生物相容性差、排斥反應和傳染風險等課題。
爲克服這些課題，本研究利用品質穩定、易於管理，而且理論上可以無限擴增培養的iPS細胞，誘導了有望分泌免疫調節分子和外泌體及開墾受損組織等的間充質幹細胞（iMSC），製備了神經導管。此次使用的iMSC是在神經嵴細胞（NCC）的介導下透過iPS細胞誘導爲iMSC的，可以在各個階段擴增培養、冷凍保存及評估品質，而且是透過排除了動物源成分的方法誘導的。考慮到未來的臨牀應用，這些特徵被認爲是巨大的優點。
研究結果
1. 生物3D神經導管的製備
首先在溫度響應板上培養iMSC，生成細胞膜片，然後將細胞膜片轉移到低粘性板上，製備塊狀iMSC（clump-iMSC, 以下簡稱C-iMSC，圖1A、B）。利用生物3D列印機，將直徑爲500±50μm的C-iMSC配置在9×9的劍山上，並進一步培養，製備管狀結構體（生物3D神經導管）。透過染色，應答C-iMSC及生物3D神經導管的iMSC周圍存在細胞外基質（I型膠原蛋白，圖1C）。對生物3D神經導管各個製備階段的基因表現進行全面解析發現，iMSC、細胞膜片、C-iMSC及生物3D神經導管的基因表現模式與骨髓源間充質幹細胞相似。
圖1：利用不含動物源成分的iMSC製備生物3D神經導管
A：生物3D神經導管的製備方法
B：製備生物3D神經導管的各個階段的影像
C：C-iMSC和生物3D導管的截面影像
Col1：I型膠原蛋白
2. 生物3D神經導管的移植
接下來，爲調查生物3D神經導管的冶癒效果，向大鼠的坐骨神經切斷模型進行了移植。做完移植手術8周後進行肉眼觀察，應答了導管的形態和對周圍組織的影響。在生物3D神經導管移植組和作爲對照組使用的矽膠管移植組，所有大鼠的切斷神經都恢復了連接。另外，生物3D神經導管在8周後依然保持形狀不變，有趣的是，表層明顯觀察到了新生血管。觀察生物3D神經導管的横向截面和縱截面發現，生物3D神經導管的中心部分有再生神經，其周圍出現新生血管。而矽膠管移植組僅觀察到了非常細的再生神經。
3. 再生神經的功能恢復
爲調查生物3D神經導管移植組的功能恢復情況，研究團隊實施了下述評估。
首先透過針刺測試評估了感覺神經的恢復情況。將痛覺刺激的程度分爲1~3三個等級（3級反應最強烈），手術8周後，生物3D神經導管移植組的所有大鼠都被評爲3級（圖2A）。矽膠管移植組有1只大鼠被評爲3級，5只大鼠被評爲2級。兩組均觀察到感覺神經的功能恢復，但兩組之間存在顯著差異，生物3D神經導管移植組的感覺神經功能恢復得更好。
然後透過展趾測試評估了運動神經的恢復情況。將腳趾的伸展程度分爲1~3三個等級（3級伸展最大），手術8周後，生物3D神經導管移植組有5只大鼠被評爲3級，1只大鼠被評爲2級（圖2B）。而矽膠管移植組有1只大鼠被評爲2級，3只大鼠被評爲1級，2只大鼠被評爲0級。兩組之間存在顯著差異，生物3D神經導管移植組的運動神經功能恢復得更好。
爲評估行動功能的恢復情況，測量了在跑步機上走路時後肢的運動特性。關於平均拖足（DT）情況，生物3D神經導管移植組和矽膠管移植組之間沒有顯著差異（圖2C）。生物3D神經導管移植組的足部仰角（AoA）比矽膠管移植組大（圖2D）。
爲應答新成長的軸突是否到達目標肌肉的神經肌肉接頭，研究團隊對足部的内收肌進行了電生理學研究。生物3D神經導管移植組顯示出了遠遠高於矽膠管移植組的振幅（圖2E）。平均運動神經傳導速度（MNCV）也是生物3D神經導管移植組高於矽膠管移植組，不過差別並不明顯（圖2F）。這些資料表明，生物3D神經導管移植組的目標肌肉再次受到了強烈的神經控制。
最後，爲檢查末梢神經傷害引起的肌肉萎縮，測量了脛前肌的肌肉溼重。觀察發現，肌肉重量也是生物3D神經導管移植組明顯重於矽膠管移植組（圖2G）。這表明，矽膠管移植組的肌肉萎縮更嚴重。生物3D神經導管移植組的肌肉萎縮程度較輕，因此從恢復的初期階段開始，目標肌肉就再次受到了神經控制。
圖2：手術後8周的功能恢復情況
A：針刺測試（感覺神經的恢復情況）
B：展趾測試（運動神經的恢復情況）
C：拖足（DT）
D：足部仰角（AoA）
E. F：電生理學解析
振幅（Amplitude）與運動神經傳導速度（MNCV）
G：脛前肌的肌肉溼重（WMW）
4.再生神經的組織學解析
爲評估再生神經，研究團隊進行了組織學解析。
透過甲苯胺藍染色法觀察發現，生物3D神經導管移植組中央部分（圖3A-a、c、e）的有髓軸突數量比矽膠管移植組（圖3A-b、d、f）多。利用穿透電子顯微術（TEM）觀察應答，生物3D神經導管移植組存在帶有形態正常的髓鞘的有髓軸突。另外發現，與矽膠管移植組相比，生物3D神經導管移植組的有髓軸突直徑明顯更大，髓鞘也更厚。除此之外還發現，生物3D神經導管移植組的G比（軸突直徑÷髓鞘直徑）明顯小於矽膠管移植組。以上結果證明，關於再生軸突的形態，目前的生物3D神經導管（人iMSC）移植組在有髓軸突的量和質兩方面都優於矽膠管移植組。
圖3：再生神經的組織學解析
A：（a-d）光學顯微鏡下的横向截面（甲苯胺藍染色法），（e、f）穿透電子顯微術的極薄横向截面比例尺：（a、b）1000μm，（c、d）50μm，（e、f）2μm
B：生物3D神經導管移植組的髓鞘化軸突數量多，軸突直徑大，髓鞘厚（P<0.01）
5.生物3D導管促進神經成長及促進血管成長的可能性
衆所周知，MSC會生成各種分泌性因子。因此，研究團隊評估了生物3D神經導管是否表達神經生長因數和血管生長因子。透過全面進行基因表現解析發現，各生物3D神經導管在各個階段都表達與神經生成和血管生成有關的基因。另外，還透過RT-qPCR應答了與典型的神經成長（NGF、NRG1、TRAF6及HGF）和血管成長（VEGFA、VEGFB、ANGPT1及ANGPT2）有關的基因表現。這些資料表明，移植前的生物3D神經導管可能透過促進神經成長和促進血管成長的功能來支援神經再生。
6. iMSC生成新血管的可能性
由於生物3D神經導管表達血管新生促進因子，而且導管周圍肉眼觀察到了豐富的新生血管，因此研究團隊在去端肽膠原蛋白海綿（Pelnac）中植入iMSC，並移植到大鼠皮下，進行了2周的觀察（圖4A）。植入iMSC的Pelnac移植組（iMSC移植組，圖4A左）的新生血管總面積存在比Pelnac移植組（圖4A中央）或硅移植組（圖4A右）大的傾向（圖4B）。觀察發現，iMSC移植組的新生血管長度明顯比Pelnac移植組及硅移植組的新生血管長（圖4C）。最後評估了血管網的形成情況，研究團隊觀察到，iMSC移植組的新生血管封閉網路數量，遠遠高於Pelnac移植組和硅移植組的網路（圖4D）。這些結果表明，皮下移植的iMSC比作爲對照組（Pelnac組）的單獨Pelnac更強烈地誘導了血管的穩定形成。
圖4：皮下移植的新生血管分析
A：三個移植組在手術用顯微鏡下的肉眼照片，iMSC移植組的新生血管更多，比例尺爲1mm
B：iMSC組的新生血管總面積（* P<0.01）
C：iMSC組的新生血管全長度（** P<0.05，* P<0.01）
D：iMSC組的新生血管封閉網路數量（* P<0.01）
結論
本研究驗證了利用人iMSC（利用不含動物源成分的方法製備）製備的生物3D神經導管對末梢神經再生的有效性和機制。生物3D神經導管對末梢神經再生的有效性已透過纖維母細胞和牙齦源MSC應答過，但此次研究使用了iPS細胞源MSC（iMSC），就這一點而言比較新穎。
另外，透過以往的研究已經知道，切斷神經周圍新形成的血管成爲雪旺細胞穿過切斷部位的支架，爲軸突再生提供了良好的環境。本研究應答，生物3D神經導管的内側和外側都形成了新的血管，另外還透過向大鼠進行皮下移植應答iMSC具有誘導血管新生的能力（圖4）。以上結果表明，利用iMSC製備的生物3D神經導管可能在新生血管的介導下爲末梢神經再生做出了貢獻。
爲推進臨牀應用，今後應該還需要進一步研究安全、有效性和成本，不過此次的研究結果表明，源自iMSC的生物3D神經導管有望在神經缺損冶癒中取代神經自體移植片。
論文資訊
題目：Pro-angiogenic scaffold-free Bio three-dimensional conduit developed from human induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells promotes peripheral nerve regeneration
期刊：Scientific Reports
URL：nature.com/articles/s41598-020-68745-1
文：JST客觀日本編輯部
