本文根據大阪大學研究成果編譯而成
大阪大學研究生院醫學系研究科幹細胞應用醫學領域的捐贈講座教授林龍平、眼科學先導性跨學科研究機構生命醫科學融合前緣研究部門的教授西田幸二與眼科學幹細胞應用醫學領域的特任研究員能美君人等人組成的研究團隊，在日本醫療研究開發機構（AMED）的支援下，確立了利用人iPS細胞培養具有粘液素分泌功能的功能性結膜上皮的新方法。
眼球表面由角膜和結膜組成，結膜負責維持淚液層，當其功能減弱時，眼球表面會變得幹澀，從而發生乾眼症等疾病。研究團隊此前曾成功利用人iPS細胞誘導了角膜上皮，但一直不清楚誘導結膜上皮的方法。
此次研究團隊發現，透過用利用人iPS細胞誘導的二維眼類器官激活EGF接受者訊號，選擇性誘導結膜細胞。對利用細胞分選儀分離出來的iPS細胞源結膜上皮祖細胞進一步進行成熟培養發現，要想分化爲結膜上皮和杯狀細胞，需要添加KGF（圖1）。
圖1：研究概要
含有利用人iPS細胞誘導的各種眼部細胞的類器官——自發形成的外胚層多重區域（SEAM）的Zone 3存在眼表上皮祖細胞。在分化培養中，EGF促進分化爲結膜上皮祖細胞，KGF促進分化爲角膜上皮祖細胞。另一方面，結膜上皮祖細胞向結膜上皮及杯狀細胞成熟分化時需要添加KGF。
利用該研究成果能大量得到此前難以培養的人眼結膜細胞，在針對乾眼症等的新藥研究和再生醫療研究方面有望取得重大進步。
研究背景
眼球表面主要由結膜上皮和角膜上皮組成，角膜覆蓋在黑眼球部分，結膜覆蓋在眼瞼内側和眼球表面至黑眼球周圍的部分。這些部分必須相互配合工作才能有良好的視力。結膜上皮的重要作用是透過向淚液中分泌粘液素（MUC5AC等）來保存眼球表面。如果疾病或發炎等導致結膜的粘液素分泌功能減弱，眼球表面會變得幹澀，從而發生乾眼症。但與角膜上皮相比，結膜上皮的研究比較落後，因爲很難獲得人結膜細胞，而且也一直未能確立結膜細胞的培養方法。
研究團隊此前曾確立了利用人iPS細胞誘導含有各種眼細胞的類器官——自發形成的外胚層多重區域（Self-formed Ectoderm Autonomous Multi-zone：SEAM，圖2）的方法，利用SEAM成功培養了角膜上皮組織。但一直不清楚同爲眼表上皮的結膜上皮的分化誘導法。另外，以往的報告表明，EGF與結膜上皮、KGF與角膜上皮的表型維持和增殖有關，但不清楚這些成長因子對發育程序的具體影響。
圖2：SEAM的模式圖
SEAM形成了同心圓狀的4層結構，角膜和結膜的上皮原基——眼表外胚層在Zone 3發育。
因此，本研究的目標是，透過在適當條件下區分使用EGF和KGF，從SEAM誘導、分離和成熟結膜細胞。
研究成果
研究團隊首先比較研究了利用人iPS細胞形成SEAM後添加EGF或KGF時的變化。開始誘導分化6周後，添加EGF的SEAM（+EGF）和添加KGF的SEAM（+KGF）均在SEAM的zone 3誘導出了p63+/PAX6+眼表上皮原基（角膜和結膜上皮的原基）。另一方面，開始誘導分化10周後，添加KGF時像此前報告的一樣誘導出了角膜上皮，而添加EGF會強烈抑制向角膜上皮細胞分化（圖3A–B）。這些結果表明，添加EGF會抑制SEAM中的角膜上皮分化，誘導結膜上皮細胞。
圖3：添加EGF的SEAM抑制向角膜上皮細胞分化
A：添加EGF的SEAM（+EGF）和添加KGF的SEAM（+KGF）的免疫染色。添加EGF的SEAM在開始誘導分化10周後，抑制了角膜上皮細胞標誌物K12的表達。
B：添加EGF的SEAM和添加KGF的SEAM的基因表現分析。與免疫染色結果一樣，添加EGF的SEAM中，角膜上皮細胞標誌物（K12、K3）的表達顯著下降（p<0.01）。
接下來，研究團隊利用分離和分析眼表上皮細胞時使用的3種細胞表面標誌物（CD200、SSEA-4、ITGB4）對添加EGF的SEAM進行染色，然後利用螢光激活細胞分選術（FACS）將其分爲6部分，詳細進行了分析（圖4A）。由此發現，CD200陰性/SSEA-4弱陽性/ITGB4陽性區域（P2）的細胞在剛剛分離後不表達結膜分化標誌物，但透過進行多層化培養，會分化成含結膜杯狀細胞的成熟結膜上皮。有趣的是，進行成熟培養時，在添加KGF而非EGF的條件下，觀察到結膜杯狀細胞標誌物MUC5AC的表達量升高（圖4B–C）。另外還應答，此次研究培養的人iPS細胞源結膜上皮膜具有MUC5AC分泌功能（圖4D），在結膜標誌物的免疫染色和粘液素染色中也表現出與正常的結膜上皮相同的特徵（圖4E–F）。
圖4：對源自添加EGF的SEAM的結膜上皮祖細胞區域（P2）進行分離，透過用KGF進行成熟培養製作結膜上皮組織
A：添加EGF培養的SEAM（10～12周）的FACS分析及各細胞羣的分離。
B：對源自P2及P3區域的上皮細胞進行培養後實施的MUC5A免疫染色。
C：不同培養條件下的MUC5AC陽性細胞數量。
D：透過ELISA測量培養液中的MUC5AC濃度。Control, 僅培養基；ND：Not Detected。
E：人iPS細胞源結膜上皮組織的免疫染色。
F：PAS染色（粘液素染色）。
另外研究團隊還發現，不僅是EGF，其他EGF接受者配體TGF-α和Amphiregulin也能誘導分化結膜上皮祖細胞。
如上所述，此次的研究表明，EGF等的EGF接受者介導的訊號對透過人iPS細胞分化結膜上皮類細胞（結膜上皮細胞、杯狀細胞、祖細胞）非常重要，研究團隊結合SEAM法成功誘導了結膜上皮細胞。另外，研究團隊還利用KGF成功培養了此前難以培養的具有杯狀細胞的功能性結膜上皮。本研究表明，EGF等的EGF接受者配體對眼表上皮細胞分化爲結膜上皮祖細胞、KGF對結膜上皮祖細胞成熟爲結膜上皮至關重要。
利用此次的研究成果可以透過iPS細胞誘導分化此前難以獲得的人結膜細胞，可作爲分析結膜和角膜等眼表上皮的功能和明確其發育程序的研究工具利用。此外，還有望用來研究靶向結膜細胞治療乾眼症等眼部疾病的新藥，以及作爲開發眼表再生冶癒法的研究工具使用。
論文資訊
題目：Generation of functional conjunctival epithelium, including goblet cells, from human iPSCs
期刊：Cell Reports
DOI：10.1016/j.celrep.2021.108715
日語發佈資料
編譯：JST客觀日本編輯部
