科學研究 - 【人物】細胞粘附分子「鈣粘蛋白」的發現者——竹市雅俊（下）

不落俗套另闢蹊徑

晶狀體分化研究是由岡田教授本人主持的，之後陸續有安田國雄（後任奈良先端科學技術大學院大學校長）和近藤壽人（後任大阪大學教授）等人加入，該項研究確定了在晶狀體細胞中發揮作用的結晶素基因的結構，併成爲岡田教授實驗室的一箇中心主題。該項研究與視網膜細胞「分化和轉化」爲晶狀體細胞的研究有關。換句話說，現在盛行的研究在30年前就已經是岡田教授研究室的研究題目了。

在培養晶狀體細胞時，首先用一種叫做胰蛋白酶的酶將它們打碎，然後鋪在培養皿上。細胞之間的粘附關係被打破後，細胞一個個變成了圓形，它們會沉到底部，粘在盤子上形成一個擴散的形狀，但它們的粘附方式因條件不同而不同。然而，細胞附着在培養皿上的方式因條件不同而不同。在加入視網膜培養液成分時，細胞附着在培養皿上的速度更慢。

但是很快竹市開始厭倦簡單地觀察晶狀體細胞的分化，因爲什麼有趣的事情都沒有發生。他覺得這個程序裏面可能有一些有趣的東西。因爲細胞粘附在培養皿上的現象可以透過改變培養條件來「操縱」，所以可以透過建模並測試的方法來做分析新實驗。因爲視網膜培養液中含有多種蛋白質，所以他嘗試用血液中的常見成分白蛋白作爲模式，觀察是否有某種特定的蛋白質參與粘附，結果發現粘附被延遲了。當他把該結果上報之後，岡田教授也覺得這個發現很有趣。但當岡田教授問他打算如何開展晶狀體的研究時，一籌莫展的他幾乎要選擇放棄，而轉爲研究細胞粘附的課題。因爲岡田教授當時正在進行關於腎臟肢解後的細胞重新組合和分類的開創性研究，所以對他的決定表示了理解和支援。但在當時來說，和細胞分化相比，細胞粘附只是胚胎學中的一個小課題。從某種意義上說，他勇敢地走出了自己的舒適區，抱着一定會有新發現的信念，在精神上得到了解脫。

纖維細胞粘附在塑膠或玻璃基質上的兩種模式。
(A) 培養基不含蛋白質。在這種情況下，細胞附着在基質上不需要任何生理條件，如二價陽離子和生理溫度。
(B) 培養基含有蛋白質，這些蛋白質被吸附在基質表面，導致細胞附着在蛋白質塗層的基質上。Mg2+或Mn2+促進這種附着，而Ca2+在這個程序中效果較差。另一方面，Ca2+對促進細胞-細胞粘附很重要。

竹市在發現培養基中蛋白質的存在會延遲粘附後，又研究了鈣離子和鎂離子的影響。雖然已經知道這些二價陽離子參與了粘附，但經過更仔細的研究，才得以區分出細胞粘附在培養皿上需要鎂離子，而細胞之間的粘附需要鈣離子。因此，他推測細胞之間的粘附和培養皿等非細胞之間的粘附是兩種不同的現象，並且有不同的蛋白質參與其中。但是細胞中有許多蛋白質，沒有辦法找出哪一種蛋白質參與粘附，也就是說當時沒有合適的方法來檢驗這個推測。正當他以爲自己的研究又走進死衚衕的時候，岡田教授建議他出國深造。在岡田教授曾經求學的卡内基科學研究所（Carnegie Institution for Science）裏，迪克·帕加諾（Dick Pagano）實驗室正在開展微脂體的人造膜和細胞膜之間的相輔作用的研究，爲了尋找研究的突破口，他於1974年踏上了赴美研究之路。

1975年江口吾朗（左）和竹市雅俊（右）在巴爾的摩的合影。（圖片出處：2004 年 2 月國際發育生物學雜誌）

峯迴路轉勇於探索

在卡内基科學研究所的實驗室裏，竹市使用的是一種名爲V79的倉鼠衍生細胞系來觀察細胞的粘附性，他在研究其基本特性時遇到了一個從未見過的奇怪現象。之前在京都大學的實驗室裏，當培養的細胞被胰蛋白酶分解，然後在培養液中旋轉時，細胞會重新組合。然而在這裏，即使執行同樣的程式，V79細胞卻沒有重新組合。當他檢查溶液的成分是，發現其中含有一種叫EDTA的化學物質，它可以抵消鎂、鈣等二價離子的作用。最終，他意識到，胰蛋白酶溶液中是否存在鈣離子會導致至關重要的區別。當用胰蛋白酶溶液處理細胞時，如果存在鈣，其粘附性就會被保留下來，如果沒有鈣，其粘附性就會消失。透過更深一步的觀察後發現，細胞之間的粘附既是鈣依賴性，也是鈣非依賴性的，而鈣依賴性機制擔負的粘附。而當將具有鈣依賴性粘附性的細胞與沒有這種能力的細胞進行比較時，得以推測出細胞表面某種蛋白質的存在與否是粘附的終極因數。

兩年的博士後研究生活結束之後，竹市回到了京都大學，集中精力探明是何種蛋白質。當時，用於搜尋未知蛋白質的方法是篩選抑制蛋白質活性的抗體。這種方法後來演變成了單源抗體篩選法。如果能夠獲得與V79細胞的粘附蛋白反應的抗體，那麼這些抗體應該能夠抑制鈣依賴性的細胞粘附。該抗體應作爲鑑定粘附蛋白的工具。然而，儘管他嘗試了許多方法，但根本無法獲得這種抗體。正當他爲這個問題苦惱的時候，有一篇論文給予了他靈感。該論文中稱，當針對F9小鼠衍生細胞製作的抗體在小鼠分裂期間與受精卵發生反應時間，細胞之間的結合變得更加鬆散。他憑直覺認爲，該現象一定與其正在研究的同一種蛋白質有關，於是將細胞換成F9，順利找到了抑制其粘附的抗體。該抗體確定了負責鈣依賴性細胞粘附的膜蛋白，因此，可以建立一個細胞粘附機制的模式。負責細胞之間粘附的蛋白質被鈣離子激活，在沒有鈣離子的情況下無活性，同時它容易被蛋白酶（如胰蛋白酶）分解。之所以在F9上取得突破，可能是因爲F9所具有的鈣粘蛋白類型更容易被識別爲抗原。岡田教授催促他儘快給這個重要的粘附分子起個名字，在與參與這項研究的其他人員後協商後，他們決定用「鈣(calcium)」和「粘附(adhere)」組合成其名稱「鈣粘蛋白（cadherin）」。

至目前爲止，人類已發現100多種不同類型的鈣粘蛋白。大多數細胞在其細胞膜上都有幾種類型的鈣粘蛋白，鈣粘蛋白的組合也因細胞而異。當各種鈣粘蛋白將細胞連接在一起時，它們會專門地與同類型的鈣粘蛋白結合。換句話說，具有相同鈣粘蛋白的細胞會相互粘附，但不會與具有不同鈣粘蛋白的細胞粘附。事實上，在20世紀50年代，美國發育生物學家約翰内斯·霍爾特弗雷特（Johannes Holtfreter）等人就發現，當組織被打散後，相同類型的細胞收歛集在一起並進行自我重建，並將此稱爲「細胞分選（cell sorting）」。由此看來，鈣粘蛋白在細胞分選中起到了一定的作用。例如在發育程序中，細胞被反復地聚攏和分離，這被認爲是透過改變細胞產生的鈣粘蛋白的類型來實施的。

現在，有很多研究者在研究鈣粘蛋白。細胞分化的研究仍是發育研究的主流，但分化的細胞是如何建體對胚胎學來說同樣重要，而研討這個問題就離不開細胞粘附。雖然看上去沒有鈣粘蛋白的發現那麼耀眼，但將細胞粘附這一難以捉摸的現象隊形變換成爲一門精密科學，竹市也感到非常自豪。他回顧了自己的研究歷程，即透過分析細胞之間的粘附和細胞與培養皿之間的粘附的區別，也透過分析鈣離子參與的細胞之間的粘附和鈣離子不參與的細胞之間的粘附的區別，也就是說他仔細地研究了與細胞粘附有關的每個單獨現象。雖然有很多研究細胞粘附的先驅者，但他們似乎沒有這樣的精確度。之所以有這樣的發現是大量研究積累的結果。旁人很難看到這些程序，但是研究成功的精髓恰恰就在於此。

竹市雅俊（左三）和高階結構形成研究小組成員的合影（圖片出處：理化學研究所官網）

竹市並沒有躺在功勞簿上睡大覺，在之後的時間裏，他開始了與大腦形成有關的研究。因爲大腦是由一千多億個神經元組成的複雜網路，雖然整體上可能看起來很複雜，但如果觀察每個細胞的話，會發現它正在延伸一個軸突，與另一個細胞建立突觸連接，所以這仍然是一個粘連的問題。透過研究已經發現鈣粘蛋白也參與了突觸的形成，而且不同的鈣粘蛋白在大腦的不同特定區域發揮作用。除此之外他也開始了與癌症相關的研究。因爲許多癌細胞已經失去了鈣粘蛋白的活性。這種癌細胞離開原有組織，轉移並侵入其他組織而成爲惡性腫瘤。在某些情況下，鈣粘蛋白本身已經從細胞中丟失，但在大多數情況下，雖然細胞中仍有鈣粘蛋白，但它不能正常工作。如果能夠查明發生這種情況的終極因數，或許就能研發出一種預防癌症轉移的方法。

在被問及如何才能成爲一名優秀的研究者時，竹市回答說需要對未知領域有一個準確的認知，即要了解哪些是自己不知道的，又要認識到可以開展哪些研究來開拓未知領域。找到這個感受的最好方法就是做自己喜歡的事情。正是一個人所熱愛的事物才會讓這個人變得充滿激情，也才能夠看到未知的深度。正如他從讀研究生的時候開始就一直在做自己想做的事情一樣，雖然和現在相比，當時的學術界並不成熟，研究方法本身也處於混亂狀態。正因如此每個研究者都需要主動去探索自己感興趣的領域。相反，現在的資訊量太大，實驗室的管理已經系統化，爲了有效地收集資料，研究主管需要對研究進行控制，密切注意實驗室裏的主要課題政策。即便如此，不少真正有趣的研究是作爲研究人員的自由研究的意外成果出現的。研究主管提出的假說往往只是一個起點，科研工作往往不會按照最初的設想前進，需要嘗試走過各種蜿蜒曲折的途徑，其中既有死衚衕也會有意想不到的近道，生命現象並不是簡單到僅靠人的思維就能解決的。唯有熱愛生命現象，才能在漫長的研究道路上越走越遠。

參考文獻
1. The International Journal of Developmental Biology , February 2004 ,48(5-6):387-96
2. The EMBO Journal, January 2018, 5(10):2485-2488
3. 京都大學公關雜誌 2020年秋季號

供稿：馬佳宥
編輯修改：JST客觀日本編輯部