日本理化學研究所（簡稱理研）BDR（Center for Biosystems Dynamics Research）中心的金堅石博士和城口克之教授等與京都大學合作，成功開發出了名爲BarBIQ（Barcoding Bacteria for Identification and Quantification）的高通量菌羣分析新技術。該技術基於16S rRNA基因測序和單細胞標籤等技術，實施了對菌羣中單細胞（細菌個體）的精確鑑定和細胞數的定量，對單細胞中16S rRNA序列的鑑定可以同時達到單鹼基正確率和單鹼基解析度，是目前唯一可以同時做到既見「森林」（菌羣整體）又見樹木（細菌個體）的菌羣分析方法，開創了菌羣研究領域的先河（圖1）。該技術未來可用於腸內菌羣相關疾病的理解和診斷，還可以高精度測量皮膚、口腔、植物、土壤、海洋以及大氣中存在的菌羣，具有廣泛的科學用途。相關内容已經發布在《Nature Communications》線上版上（2月22日）。
圖1 單細胞菌羣分析方法示意圖
人類的腸道居住着約500～1000種細菌，近100萬億個細菌，這種細菌組成的群體被稱爲「菌羣」。腸內菌羣的平衡與腸内免疫以及健康密切相關，所以準確測量各種細菌的分佈情況是極爲重要的。此次，該研究團隊將細菌逐一封入液滴，並對每個細菌的16S rRNA基因標記上不同的被稱爲條形碼的DNA序列，從而實施了一次性對10萬個以上的細菌的種類的鑑定和各種類細菌的定量。利用這種方法，他們精確測定了小鼠經維他命A缺乏食物餵養後其盲腸內菌羣的微小變化。
BarBIQ方法是在城口克之等人先後於2012年和2017年發表的DNA分子條形碼標記法基礎上開發成功的。該方法將菌羣中的細菌單細胞一個個封裝入液滴，並在DNA擴增中對每個細菌細胞的16S rRNA基因標記上唯一的DNA系列（這種策略也被稱爲細胞條形碼標記）。具體操作如下。
① 菌羣中的細菌單細胞和一個具有唯一序列的單分子DNA（細胞條形碼）被共封裝入液滴 （圖2）。
圖2 BarBIQ法示意圖
② 細菌中的16S rRNA基因被擴增並和同一液滴中的細胞條形碼相連接。因此不管來自同一個細菌的16S rRNA基因有多少個或者多少種，都將被標記上相同的細胞條形碼（圖2）。這是實施單細胞分析的關鍵步驟。
③ 液滴中所有被擴增的DNA被純化和二代測序分析後，16S rRNA基因序列和細胞條形碼會被成對讀出。之後，16S rRNA基因序列被用來鑑定細菌的種類，而細胞條形碼則被用來確定這些16S rRNA基因序列來自哪個細胞。
圖3 BarBIQ法與傳統方法的比較
16S rRNA基因在不同種類細菌中具有不同的序列，因此被廣泛用來鑑定細菌的種類。BarBIQ方法在DNA擴增時，每個細菌細胞都被隔離在一個液滴中，因此不同細菌的16S rRNA基因不會被嵌合擴增成不準確的DNA產物，而大量擴增出來的DNA嵌合體正是造成傳統方法鑑定16S rRNA序列不準確的主要原因之一。
另外，BarBIQ方法中每個細菌被不同的細胞條形碼標記，所以哪怕只有一個鹼基不同的16S rRNA序列，也能被鑑別出是來自不同細菌的還是來自同一細菌的相似序列。因此，BarBIQ方法相比於傳統方法，首次實施了基於細胞的16S rRNA序列鑑定，同時還具有單鹼基準確率和單鹼基解析度（圖3）。
此外，因爲每個細菌個體都是被不同細胞條形碼標記的，即使是相同的細菌也能透過被標記的條形碼區分開，因此BarBIQ方法可一次性鑑定超過10萬個細菌的種類還能對每一種鑑定細菌進行細胞計數。而傳統方法無法追蹤每個細胞，因此只能實施對被擴增16S rRNA分子的鑑定和計數（圖3）。
圖4 封入細菌的液滴
左爲剛做好的液滴明場顯微鏡影像；右爲液滴中細菌DNA經螢光染色後的螢光影像。箭頭所指處爲觀察到的細菌
論文：
Jianshi Jin, Reiko Yamamoto, Tadashi Takeuchi, Guangwei Cui, Eiji Miyauchi, Nozomi Hojo, Koichi Ikuta, Hiroshi Ohno, Katsuyuki Shiroguchi, High-throughput identification and quantification of single bacterial cells in the microbiota, Nature Communications (2022) doi.org/10.1038/s41467-022-28426-1.
文 曹暉 JST客觀日本
