東京工科大學應用生物學部的吉田亙副教授和松井徹教授等人組成的研究團隊，成功開發出了只需混合試劑即可簡單、快速地測量有望作爲癌症和中樞神經系統疾病生物標誌物使用的基因體DNA羥甲基化水平的方法。
有報告顯示，DNA去甲基化反應的中間產物5-羥甲基胞嘧啶可作爲阿茲海默症等中樞神經系統疾病的生物標誌物使用，但一直沒有簡單易行的量測方法。研究團隊此前開發了使用甲基CpG結合蛋白融合螢光酵素測量基因體DNA的甲基化CpG水平的方法。此次則利用了在與基因體DNA結合的DNA嵌入劑和甲基CpG結合蛋白融合螢光酵素之間發生的生物發光共振能量轉移現象。
爲測量羥甲基化水平，研究團隊着眼於羥甲基化CpG結合蛋白UHRF2的SRA結構域。首先，重組生成了在UHRF2 SRA中融合源自螢火蟲的發光蛋白螢光酵素的蛋白質（UHRF2 SRA-Fluc）。UHRF2 SRA不僅與羥甲基化CpG結合，還與甲基化CpG結合，因此研究團隊爲抑制UHRF2 SRA與甲基化CpG結合，還重組生成了甲基化CpG結合蛋白MBD。
圖1：基因體中的5-甲基胞嘧啶和5-羥甲基胞嘧啶
此類修飾含氮鹼基的異常狀態有望被用作檢測癌症與中樞神經系統疾病的生物標誌物。（供圖：東京工科大學）
接下來結合DNA嵌入劑和MBD製備了人類基因體DNA，並添加UHRF2 SRA-Fluc和螢光素酶發光基質。結果顯示，UHRF2 SRA-Fluc在人類基因體DNA中的羥甲基化CpG位點發光，並激發附近的嵌入劑。另外還發現，其螢光強度取決於人類基因體DNA的羥甲基化水平。
研究團隊由此應答，只需在靶基因體DNA中混合UHRF2 SR-Fluc、MBD、嵌入劑及螢光酵素發光基質，並測量螢光強度，即可在40分鐘内測量出羥甲基化水平。
圖2：人類基因體内5-羥甲基化修飾頻率檢測法的檢測原理
UHRF2 SRA-Fluc與CpG序列羥甲基化的結合與接近，將螢光酵素所產生的能量轉移到相鄰DNA分子螢光探針，使其發出發射光。所有反應可在一個反應階層内同時進行，因此只需將所有物質混合就可達成檢測。（供圖：東京工科大學）
吉田副教授表示：「這種方法的優點是，構建識別特定修飾鹼基的蛋白質與螢光酵素的融合蛋白，就可以在同一平台上測量修飾鹼基。另外，融合最大發光波長不同的螢光酵素還可以同時測量多個修飾鹼基。今後將開發測量各種修飾鹼基的方法，並確立與這些修飾鹼基狀態異常有關的疾病的診斷方法。」
【詞注】
■羥甲基化：甲基胞嘧啶被甲基胞嘧啶氧化酶氧化生成羥甲基胞嘧啶的反應。
■CpG：由胞嘧啶與鳥嘌呤的連續鹼基序列構成的DNA。
原文：《科學新聞》
翻譯編輯：JST客觀日本編輯部
【論文資訊】
期刊：Analytical Chemistry
論文：Quantification of global DNA hydroxymethylation level using UHRF2 SRA-luciferase based on bioluminescence resonance energy transfer
URL：pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.1c05619
