東京工業大學科學技術創成研究院北口哲也副教授和生命理工學院研究生伊藤良浩等人組成的研究團隊與味之素公司共同開發出了一種可快速製作高分泌生產生物醫藥物的有用蛋白質微生物菌株的新型高通量篩選方法。相關成果已發表在《Small》線上版上。
圖1.使用小滴培養和生物感測器Q-body的蛋白質高分泌生產菌株篩選方法示意圖（供圖：東京工業大學）
（a、b）將含有分泌目標蛋白的微生物及Q-body的溶液倒入微流路，並用油（Oil）剪切，製備Water-in-Oil（油包水）乳劑
（c）在乳劑中培養微生物，用分泌生產生物感測器透過螢光檢測出目標蛋白
（d）爲了防止篩選程序中的乳劑破損，將乳劑倒入微流路，製備受油層保存的Water-in-oil-in-water（水包油包水）乳劑
（e）以螢光強度爲指標篩選和回收分泌目標蛋白的乳劑
在生物醫藥物的製造中，利用微生物分泌生產蛋白質的方法因其成本低、不含動物來源成分等優點而被廣泛應用。另一方面，製作高水平分泌生產蛋白質的工業用微生物菌株需要導入多個有助於蛋白質分泌生產的基因改造，因此存在開發週期長的問題。
作爲在短時間内對大規模基因改造微生物菌株庫進行培養評估的方法，研究團隊着眼於將W/O/W（Water-in-oil-in-water，水包油包水）乳劑（小滴的一種）作爲培養反應器的超並列培養。研究了在直徑約30微米的乳劑中逐株封入基因改造微生物菌株，在乳劑内進行菌體增殖、目標蛋白的分泌生產，並選擇回收蛋白質分泌生產能力提高的菌株的篩選方法。使用淬滅抗體Q-body作爲檢測乳劑內分泌的目標蛋白的方法。Q-body由螢光標記的抗體片段構成，當與作爲抗原的蛋白質結合時，螢光強度因抗原濃度依賴性迅速增加，因此有望用作乳劑培養的生物感測器。
研究團隊首先驗證了是否可以在乳劑中使用Q-body檢測目標蛋白濃度的變化。作爲檢測成長因子一種的人FGF9（重組人纖維母細胞生長因子9）的生物醫藥物的模式，準備了各種濃度的融合了Q-body響應肽序列的FGF9，與螢光染料TAMRA修飾scFv型Q-body一起封入乳劑中，透過流式細胞分析技術分析了螢光強度。在FGF9摩爾濃度爲10-1000奈米摩爾的範圍内，觀察到濃度依賴性螢光強度擧升，表明在乳劑中使用Q-body檢測蛋白質是可能的。
其次，研究團隊將分泌生產該FGF9的革蘭氏陽性菌Corynebacterium glutamicum及不分泌FGF9的陰性對照菌株與Q-body一起封入乳劑中進行培養，並用細胞分選儀研究了FGF9分泌生產菌株能否以螢光爲指標選擇性回收。結果發現FGF9分泌生產菌株封入乳劑的螢光強度明顯高於陰性對照菌株封入乳劑，透過用Q-body對分泌的FGF9進行螢光檢測，成功地僅回收了FGF9分泌生產菌株。
此外，針對FGF9分泌生產菌株，構建了包括用化學誘變劑 N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍誘變的超過10 7個突變菌株的庫，其中約10 5個變異株在乳劑内培養，並證實了可以用細胞分選儀選擇性回收顯示出高螢光強度的約前50株。對篩選獲得的變異株羣進行培養評估後得出，與變異處理前相比，FGF9分泌產量明顯提高，併成功獲得了相對於非變異處理株，分泌量最大增加約3倍的菌株。
由此，迅速篩選現有方法無法實施的龐大菌株庫成爲可能，並證明了使用小滴培養和Q-body的蛋白質高分泌生產菌株篩選方法的有效性。
透過此次開發的方法，能夠快速製作近年來需求增加的生物醫藥物的工業用微生物菌株，且有望在數年内實施各種生物醫藥物的低價供給。據研究團隊介紹，今後，在促進生物醫藥物研究開發的實際應用的同時，還會向生物醫藥物以外的有用蛋白質橫向展開。另外，作爲檢測精度更高的生物感測器，將進一步探討利用福斯特共振能量轉移的Q-body等提高篩選方法的效率和精度。
原文：《科學新聞》
翻譯：JST客觀日本編輯部
【論文資訊】
雜誌：Small
論文：Efficient Microfluidic Screening Method Using a Fluorescent Immunosensor for Recombinant Protein Secretions
DOI：10.1002/smll.202207943
