京都大學研究生院工學研究科的浜地格教授、田村朋則講師、高遠美貴子博士研究生（研究當時）等人開發出了一種可以分析活體動物腦内突觸中神經遞質接受者附近存在的蛋白質的新方法。該方法被命名爲「PhoxID法」，由於無需進行基因重組等操作，能夠在更加自然狀態下獲得蛋白質相輔作用的影像。研究團隊利用這種方法不僅揭示了小鼠腦内AMPA接受者中存在的外周蛋白隨年齡變化的情況，還發現了一些此前未知的變化。田村講師表示：「理論上這種方法可適用於以所有蛋白質爲目標的鄰近蛋白質分析。該技術關鍵的光敏劑可以在生化實驗室中輕鬆合成，因此我們希望該技術能被更多的人使用，所以未申請專利。」該研究成果已發表在期刊《Nature Chemical Biology》上。
田村朋則講師（供圖：京都大學）
明確神經遞質接受者的蛋白質-蛋白質相輔作用網路（相輔作用組）對於理解複雜的大腦功能，如記憶和學習等至關重要。然而，傳統方法仍存在一些問題。比如，用於鄰近標記的抗壞血酸過氧化酶（APEX）具有毒性，因此很難在活體內應用；生物素連接酶（BioID/TurboID）則必須連續7天向活體小鼠投用生物素化試劑。此外，這兩種方法都依賴於基因重組來表達復合蛋白，操作對蛋白質三級結構和相輔作用的影響令人擔心。
圖1 使用PhoxID法進行的神經遞質接受者相輔作用成分析（供圖：京都大學）
在PhoxID法中，研究團隊首先使用了獨特的蛋白質化學修飾技術（配體定向化學）來修飾與目標接受者結合的光敏劑。以AMPA接受者爲靶接受者時，研究團隊製備了一種在醯基咪唑上結合AMPA配體「PFQX」，並在另一側附着單溴螢光素（MBF）的光敏劑。將這種物質引入側腦室後，會在腦内廣泛分佈。當綠光（波長520nm）透過光纖照射到待分析區域時，會在光敏劑的作用下生成單態氧，並氧化外周蛋白。用醯肼連接去硫化生物素標記劑修飾這些氧化的蛋白質，並進行質譜分析，即可全面識別接受者相輔作用組。「單線態氧在幾百奈秒内就會消失，所以蛋白質可以擴散的距離只有幾十奈米。只能氧化目標的周圍。」（田村）
研究團隊在小鼠海馬區對AMPAR和GABA0404A接受者實施PhoxID法後，發現該方法僅需1～10分鐘的光照時間，就能成功識別出包括已知的相輔作用蛋白在内的多個接受者相輔作用組。此外，當光照部位改爲小腦時，還檢測到了已知的小腦獨特性AMPAR相輔作用蛋白。
此外，研究團隊還利用更高的時間解析度追蹤了AMPAR相輔作用組在出生後發育程序中的變化。將PhoxID法應用於8日齡、13日齡和5周齡小鼠的小腦，並進行定量質譜分析，發現隨着小鼠的成長，許多蛋白質的標記強度有強化的趨勢。這與伴隨腦部發育AMPAR的表達量增加，形成了更多的神經廻路有關。另一方面，研究還發現一些蛋白質的標記強度在13日齡小鼠中達到最高，在5周齡小鼠中顯著降低。
研究人員透過蛋白質記憶痕跡（Western Blot）分析發現，多種細胞粘附分子的表達量降低，還透過免疫染色發現，在8日齡時，細胞粘附因子NECTIN3在小腦普金斯細胞中遠離AMPAR的位置表達，而在13日齡時與AMPAR共定位。
透過PhoxID法，研究團隊首次揭示了AMPAR和NECTIN3在小鼠小腦中存在幼年期獨特性接近的現象。該現象在神經科學上的意義尚不清楚，更詳細的研究將爲神經科學提供新的知識和見解。
只要接受者的親和性配體或抗體可用於研究，PhoxID法理論上可適用於所有蛋白質、所有生物體，因此今後有望應用於更廣泛的接受者。此外，進一步將該方法與基於行為學和光遺傳學的細胞水平泛函分析技術相結合，預計有助於闡明高級腦功能的分子機制。
原文：《科學新聞》
翻譯：JST客觀日本編輯部
【論文資訊】
期刊：Nature Chemical Biology
論文：Photoproximity labeling of endogenous receptors in the live mouse brain in minutes
DOI：10.1038/s41589-024-01692-4
