日本的理化學研究所生命功能科學研究中心合成生物學研究團隊負責人上田泰己、副研究員（研究當時）秋山郁人以及客座研究員松本桂彥等人組成的合作研究團隊開發出了一種高通量和簡單的使小鼠整個器官透明化、染色、3D成像和數據分析的方法。該方法有望加速從既往利用組織剖切進行2D觀察向針對整個器官的3D生物學過渡，並為下一代藥物開發研究和病理診斷技術做出貢獻。研究成果已發表在《Nature Protocols》上。
圖1使用6孔口板的小鼠器官透明化處理（供圖：理化學研究所）
上圖為使用6孔口板對小鼠大腦進行透明化和染色的示例。用固定液（多聚甲醛）處理的不透明器官被透明化並進行核染色。顏色差異是由於用於核染色的3種試劑（PI、SYTOX-G和RD2）造成的。背景方格為2mm。
下圖為使用光片顯微鏡在低倍/寬視角下觀察透明化的肺（左）和心臟（右）的整體圖像，以及在高倍下觀察各自紅框區域的圖像。
用於對生物體內部結構進行光學觀測的組織透明化技術早在1900年左右就已問世，在過去十幾年間，該技術與光片顯微鏡的結合取得了長足進步。透明化技術主要有使用有機溶劑、使用水溶性化合物和凝膠包埋3種。
團隊負責人上田等開發出一種使用與螢光蛋白和免疫染色等相容的水溶性化合物的透明化技術CUBIC，還開發了染色、成像和分析技術。單項元素技術的性能達到了世界最高水平，但要在基礎研究和臨床實務中廣泛使用，還需要進一步簡化方案（protocol）、建立數據分析流水線（pipeline）。
此次，研究團隊開發了一個簡單且可平行處理的透明方案。迄今為止，因為每個樣品都必須放在1個試管中，澄清和清洗溶液總共要更換近20次，當樣品數量較多時，溶液更換非常耗時，所以CUBIC一直難以用於大規模研究。因此，將3D列印的透明插入裝置插入細胞培養常用的6孔培養板中，每個培養板可同時處理6個樣品，每個樣品的溶液更換速度可提高4～5倍。此外，由客座研究員松本等開發的低倍率/寬視角高速光片顯微鏡可快速生成小鼠的大腦、肺部、心臟和腎臟等整個器官的3D螢光圖像。通過增加脫色過程，該方案還能使眼球等高色料組織變得透明。
此外，研究人員還建立了一個從光片顯微鏡獲得的3D圖像中檢測細胞的程序，並將其轉換為適用於基於雲平台、可對整個小鼠大腦進行定量分析的CUBIC-Cloud格式。作為實施該流水線的一個示例，研究人員嘗試對服用了中樞神經系統藥物的小鼠大腦進行了切除、透明化、免疫染色、成像、細胞檢測和定量分析，通過視覺化掌握了藥物對整個大腦的影響。
免疫染色使用了神經活動標記物c-Fos的抗體。通過檢測c-Fos陽性細胞並在CUBIC-Cloud上對其進行分析，可以分析出整個小鼠大腦中哪些神經元被激活，以及哪些區域因小鼠是否接受藥物治療而存在差異。分析結果表明，從透明化到分析的流水線可評估藥物對中樞神經系統的影響。
在這一示範實驗中，研究人員對藥物誘導神經活動進行了全面的定量分析，該方法也可應用於視覺化和定量評估抗體和核酸藥物在器官中的輸送位置以及積聚位置等。此外，由於透明化技術可以觀察到組織和器官中的所有細胞，因此即使是轉移性癌細胞和幹細胞等極少陣列織中存在的細胞，也能被觀測和量化，而不會遺漏。
從利用組織剖切的2D生物學轉向利用整個器官的3D生物學，有望提高包括藥物發現和臨床研究在内的各個領域的研究效率。
原文：《科學新聞》
翻譯：JST客觀日本編輯部
【論文資訊】
期刊：Nature Protocols
論文：A multiwell plate approach to increase the sample throughput during tissue clearing
DOI：10.1038/s41596-024-01080-1
