拉曼顯微鏡能夠在無需初步處理的情況下測量樣本的內部結構和化學成分等，但其在生物樣品中的應用受到一定限制。大阪大學研究生院工學研究科的博士生水島健太（現工作於約翰霍普金斯大學）、藤田克昌教授、山中真仁特任副教授、大阪大學先導性跨學科研究機構的熊本康昭副教授等人組成的研究團隊，與大阪大學免疫學前緣研究中心的Nicholas Smith副教授、京都府立醫科大學的田中秀央特任教授、理研環境資源科學研究中心的袖岡幹子團隊總監等人合作，成功開發出了一種能夠冷凍生物樣本並以高靈敏度觀察分子的拉曼顯微鏡。藤田教授表示：「我們相信，這項技術能夠在從基礎研究到細胞產業實際應用的廣泛領域中發揮作用。我們計劃於明年創辦公司，推動商業化進程。」相關研究成果已發表在期刊《Science Advances》上。
圖1. 急速冷凍固定的HeLa細胞（人子宮癌細胞）的高信號雜音比、寬視野拉曼觀察圖像。觀察時間約為10小時。圖中的綠色、紅色、藍色分別表示細胞色素（750 cm-1）、脂質（2850 cm-1）、蛋白質（2920 cm-1）的分佈（供圖：大阪大學）
拉曼光譜術通過照射雷射後測量從樣本發出的拉曼散射光，能夠在無需初步處理的情況下非破壞性觀察固體、液體、氣體等物質的內部結構和化學成分等。該方法已經廣泛應用於材料系統等領域，但由於細胞等生物樣品的拉曼散射光微弱，提高雷射功率則會傷害樣本，而且在長時間測量過程中，樣本的化學成分會因固定而發生變化，因此技術的應用範圍較為有限。
研究團隊開發出一種通過急速冷凍並在液氮溫度下固定細胞等生物樣本，從而實現長時間的拉曼觀察的新方法。具體做法是，研究團隊開發了一種獨特的樣本室，使用-185℃的液體丙烷對樣本進行急速冷凍，此後通過周圍安裝的液氮流道進行持續冷卻或使用加熱器進行加熱，從而在調節溫度的同時固定樣本。研究團隊將100毫瓦的雷射分為數百個雷射點（每個點的功率為毫瓦級）同時照射樣本，從而實現了對大範圍區域的長時間觀察。通過該方法，研究團隊成功實現了高信號雜音比、高解析度，以及在既往方法中無法達到的數百倍寬視野拉曼觀察。水島表示：「在開發冷凍方法時，我們遇到了許多困難。尋找合適的冷凍電鏡冷凍劑時，由於冷卻劑本身也會產生拉曼散射光，我們進行了多次實驗，始終無法正常成像，最終我們找到了使用液體丙烷的方法，這個過程最為艱難。」
在實驗中，研究團隊使用本次研究開發的顯微鏡對急速冷凍固定的細胞進行了長時間的拉曼觀察，證實了該方法可以獲得比既往方法高約8倍的拉曼信號。此外，研究人員還通過急速冷凍固定缺血大鼠心臟組織中的細胞色素c的氧化還原狀態並進行拉曼觀察，首次獲得了在未固定的活體樣本中無法觀察到的缺血狀態與常態心臟組織中細胞色素c氧化還原狀態差異的顯微鏡圖像。同時，這還成功將細胞觀察中可識別的分子種類增至9種，增加到了既往方法的2倍左右。
藤田教授表示：「我們此前就有過冷凍樣本的設想，但實驗難度很大。最初，我們嘗試將冷凍樣本直接拿到顯微鏡下進行觀察，但樣本的狀態會發生變化。於是，在2018年，我們提出了將冷凍過程直接整合到顯微鏡中的想法，次年我們的計劃獲得了CREST項目的資助，因而得以實現。此次實驗的觀察時間為10至20小時，若能進一步延長觀察時間，將能夠擴大觀察範圍並識別更多的分子種類。」
在藥物研發、生殖醫學、細胞治療、再生醫學、畜牧業和基礎研究等廣泛領域中，各種生物樣本都需要被冷凍保存，而此次開發的方法同樣適用於生物樣本的品質管制和評估。事實上，大阪大學與岩谷產業公司的合作研究已表明，樣本在運輸過程中因溫度波動會導致細胞存活率下降。此外，這項新方法為高靈敏度地拉曼觀察生物樣本中低濃度存在的藥物等成分提供了可能，同時也使得觀察冷凍瞬間生物樣本中的分子化學狀態成為可能。該技術有望在廣泛的研究領域中發揮作用。
原文：《科學新聞》
翻譯：JST客觀日本編輯部
【論文資訊】
期刊：Science Advances
論文：Raman microscopy of cryofixed biological specimens for high-resolution and high-sensitivity chemical imaging
DOI：doi.org/10.1126/sciadv.adn0110
