大阪大學研究生院工學研究科的博士生辻康介、山中真仁特任副教授（全職）、藤田克昌教授，大阪大學先導性跨學科研究機構的熊本康昭副教授等人的研究團隊，與大阪大學免疫學前緣研究中心、大阪大學產業科學研究所、京都府立醫科大學等機構合作，成功開發出一種可對光學顯微鏡下正在觀察的細胞，在任意時間點以毫秒級時間速度進行冷凍固定，直接對其展開詳細觀察的「時間決固定模冷凍光學顯微鏡法」。通過掌握直至凍結固定前一刻細胞內「何種現象在何處發生」的細胞動態空間時間資訊，能夠以高定量和高空間解析度實現細胞動態「某一瞬間」的視覺化，該技術有望廣泛應用於以光學顯微鏡活體樣本觀察為基礎的生命科學及醫學領域研究，並做出貢獻。相關成果已發表在期刊《Light: Science & Applications》上。
圖1.（上）本研究的技術概念；（下）對螢光顯微鏡下正在觀察的大鼠原代培養心肌細胞內傳播的Ca 2+ 波進行急速冷凍固定。細胞中導入了在Ca 2+ 濃度升高時會明亮發光的螢光性Ca 2+ 指示劑。從圖中可確認：從細胞左上向右下傳播的Ca 2+ 波因急速冷凍而瞬間停止，冷凍前一刻細胞內的Ca 2+ 分佈狀態得以保留。（圖片出自大阪大學新聞發佈：https://resou.osaka-u.ac.jp/ja/research/2025/20250824_1 ，客觀日本編輯部翻譯）
研究團隊開發出了一款操作簡便的樣本凍結腔室，可在以光學顯微鏡觀察細胞的過程中進行急速冷凍固定，並在保持冷凍狀態的情況下對樣本展開詳細觀察。在開發的腔室中，為確保足夠的冷凍速度，會先減少細胞周圍的環域分析液量，然後注入液體異戊烷-丙烷混合冷凍劑（-185℃左右），急速凍結固定樣本。注入的混合冷凍劑會直接留在樣本上方，急速冷凍後仍能維持低溫環境。該腔室可簡單地安裝在各類市售光學顯微鏡上，若使用備用腔室部件，進行樣本更換也僅需1分鐘左右。此外，研究團隊還開發出一套通過電動控制，以±10毫秒精度將混合冷凍劑注入樣本的冷凍劑滴下裝置。
在本次研究中，研究團隊利用所開發的樣本腔室，成功實現了對細胞內高速傳播的鈣離子，以及細胞內動態運動的胞器等的瞬間凍結固定。在鈣離子分佈凍結後，通過長時間曝光大幅提高了信號雜音比，證實了凍結後能夠以高定量性對細胞進行觀察。
此外，研究團隊還成功實現了細胞內鈣離子分佈與肌動蛋白織維的雙色超分辨成像，以及細胞內鈣離子分佈的三維超分辨觀察，證明即便是需要相對較長曝露時間的觀察技術，也能夠視覺化細胞的「某一瞬間」。另外，通過利用細胞光刺激技術與電動控制冷凍劑滴下裝置，能夠以±10毫秒的精度任意決定從細胞內現象發生到凍結固定的時間。
除此之外，研究團隊還利用超分辨螢光顯微鏡和拉曼顯微鏡對冷凍後的樣本進行觀察，證實了即便是觀察耗時不同的多種光學成像技術（超分辨螢光顯微鏡的成像時間為750毫秒，拉曼顯微鏡的成像時間為25分鐘），也能對同一時間點的細胞狀態進行視覺化與分析。研究團隊將該技術命名為「時間決固定模冷凍光學顯微鏡法」。
起點在於思路轉換
藤田教授表示：「本研究始於一個大膽的思路轉換——不受曾是活細胞成像難題的‘時間限制’束縛，而將細胞的動態‘定格觀察’。本技術的特點在於，能夠在掌握細胞空間時間資訊的同時掌握凍結瞬間的狀態，並利用各類光學顯微鏡技術對其進行詳細且高定量性的觀察。我們期待該技術能為生物學及醫學領域的研究帶來新視角，並成為一項基礎技術。」
原文：《科學新聞》
翻譯：JST客觀日本編輯部
【論文資訊】
期刊：Light: Science & Applications
論文：Time-deterministic cryo-optical microscopy
DOI：doi.org/10.1038/s41377-025-01941-8
